宫再兴，徐庆刚

（江西中医药大学附属医院泌尿外科，南昌 330006）

肾透明细胞癌 （Renal Cell Carcinoma, RCC），是泌尿系统常见恶性肿瘤之一， 来源于肾实质泌尿小管上皮系统， 发病率仅次于前列腺癌和膀胱癌[1]。 目前肾癌的病因尚不明确， 可能与遗传、吸烟、肥胖、高血压及抗高血压治疗等因素有关，促使研究者从各个层面研究探讨， 寻求新的治疗策略。 长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200 nt 的不能编码蛋白质的RNA 分子， 但是可以从多个层面调控蛋白质的编码基因的表达水平[2]。近年来， 各国学者对lncRNA 的研究不断深入，发现并证实多个lncRNA 的异常表达与恶性肿瘤息息相关[3]。 肺腺癌转移相关转录本1（metastasisassociatedlungadenocarcinomatranscript1,MALAT1）是一个高度保守和丰度的lncRNA，位于人类染色体11q13.1 上，主序列包括了8000 多个核苷酸，广泛分布于人体各组织器官中， 通过多种方式在表观遗传学水平上引起肿瘤细胞的恶性增殖， 侵袭能力上升，凋亡减弱，进而影响肿瘤患者的病情进展及后期药物的治疗效果等。 我们通过干涉非编码RNA MALAT1 的表达，研究对人肾透明细胞癌细胞786-O 的影响， 为肾细胞癌的诊疗提供新的策略。

1 实验材料与方法

1.1 材料 人肾透明细胞癌细胞786-O 细胞由中国科学院（上海）细胞类型培养研究所购得，shRNA由上海依祥生物技术有限公司合成，TRIZOL 试剂购自北京全式金生物技术有限公司，MALAT1 引物、Lipofectamine 2000 reagent 均 购 自 美 国Invitrogen 公 司，qPCR 试 剂 盒 购 自TaKaRa 公 司，RPMI 1640 培养基、牛血清白蛋白（Albumin Bovine V） 均购自美国Gibco 公司，ABI7900 型Realtime-PCR 仪购自美国ABI 公司，CCK-8 Cell Counting Kit 购自诺唯赞生物， 全自动板式酶标仪购自奥地利TECAN 公司，24 孔板用细胞培养池（透明PET膜8.0 μm） 购自美国Corning 公司，PRIMER IPAGE 11-59 BP、FACSCalibur 流式细胞仪购自BD 公司，Annexin V/PI apoptosis kit 购自联科生物。

1.2 方法

1.2.1 转染 实验分三组：实验组（shRNA-MALAT1组）、阴性对照组（shRNA-NC 组）、正常培养组。 用胰蛋白酶消化细胞后并计数，将细胞以1×105/孔接种在六孔板上， 加入2 mL 含FBS 的细胞培养基，放入恒温培养箱中， 当培养的细胞数量≥80%时，按脂质体转染试剂盒LipofectamineTM 2000 说明书依次转染，每组平行3 孔，用荧光显微镜观察转染效率，便于后续试验。

1.2.2 qPCR 检测各组MALAT1 基因的表达 转染36 h 后提取RNA， 逆转录为cDNA，MALAT1 引物为5′-TGCAGCCCGAGACTTCTGT -3′，5′-GCTTC TGCGTTGCTAAAATGG-3′。 GAPDH 引 物 为5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，5′-GTGGTC GTTGAGGGCAATG-3′。 进行qPCR，95 ℃预变性30 s 后，进入40 个循环：95 ℃10 s； 60 ℃30 s。

1.2.3 CCK8 检测各组细胞生长情况 转染后的各组细胞培养至对数期， 用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，接种到96 孔板（每组设定5 个复孔），放置细胞培养箱中培养，分别于接种后0 h、24 h、48 h、72 h 加入10 μL CCK-8 溶液，继续37 ℃孵育2 h，450 nm 波长下利用酶标仪测定各孔板各组细胞的吸光值。

1.2.4 Trsanwell 小室检测各组细胞侵袭能力 用胰蛋白酶将各组细胞消化成单细胞悬液， 收集各组细胞，调整细胞密度至1～10×105个/mL，用移液枪吸取100 μL， 接种于预先铺胶4℃过夜的Transwell 上室， 加入500 μL 含趋化因子的培养基，放入细胞培养箱中常规培养48h，用棉签小心擦去上室内的细胞，4%多聚甲醛固定5 分钟后用PBS 反复淋洗，再4 g/L 的结晶紫溶液染色。 在倒置显微镜下每个样本随机取5 个单独视野并计数拍照。

1.2.5 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况 用不含EDTA 的胰蛋白酶将各组细胞消化成单细胞悬浮液， 并用预冷的PBS 洗涤。 先后加入100 μL 1 Binding Buffer 重悬细胞、5 μL Annexin V- FITC、10 μL PI 轻轻混匀，避光、室温反应5 min。 流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6 数据统计分析 使用SPSS 26.0 对实验结果进行统计学数据分析，计量资料以（±s）表示，任意两组间的数据分析使用t 检验，三组间数据分析使用单因素方差分析，P＜0.05 提示组间数据差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 转染效率检测 用荧光显微镜观察转染效率（图1A，1B）， 转染成功标准为细胞体内有绿色荧光出现，且荧光细胞占比大于80%，转染48 h 后用于后续实验。

图1 B 阴性空转组（shRNA-NC 组）转染后

图1 A 实验组（shRNA-MALAT1 组）转染后

2.2 各组MALAT1 基因的qPCR 检测 采用实时荧光定量PCR 技术检测实验组、阴性对照组、正常培养组肾透明细胞癌786-O 细胞中MALAT1 的表达量情况， 结果显示， 实验组MALAT1 表达水平（0.326±0.049）明显低于阴性对照组（1.006±0.194）和正常培养组（0.982±0.161），差异有统计学意义（P＜0.05，图2）。提示沉默lncRNA MALAT1 效果显著。

图2 MALAT1 在各组肾透明细胞癌细胞786-O 中的相对表达量（*P＜0.05）

2.3 沉默lncRNA MALAT1 的表达对各组癌细胞增殖的影响 采用CCK8 法检测实验组、阴性对照组、 正常培养组肾透明细胞癌细胞786-O 的增殖情况分别为（1.710±0.081），（1.977±0.292），（2.003±0.277），并绘制细胞生长曲线，见图3。 与正常培养组和阴性对照组相比， 实验组癌细胞增殖细胞活性明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），提示沉默lncRNA MALAT1 的表达能够明显抑制肾透明细胞癌细胞786-O 的增殖。

图3 CCK8 检测各组肾透明细胞癌细胞786-O 增殖情况曲线图（*P＜0.05）

2.4 沉默lncRNA MALAT1 表达对各组癌细胞侵袭能力的影响 采用Trsanswell 侵袭实验检测实验组、 阴性对照组、 正常培养组肾透明细胞癌细胞786-O 的穿透Matrigel 胶转移到Trsanswell 膜背面的细胞数，与正常培养组（110.40±7.925）和阴性对照组（106.40±4.722）相比，实验组（54.40±7.403）侵袭细胞个数明显降低（图4），差异具有统计学意义（P＜0.05），而与正常培养组相比，阴性对照组侵袭细胞数量无明显差异（P＞0.05，图5）。 提示沉默lncRNA MALAT1 的表达能够明显降低肾透明细胞癌细胞786-O 的侵袭能力。

图4 Trsanwell 侵袭实验检测各组肾透明细胞癌细胞数量（400 倍）

图5 Trsanswell 侵袭实验检测各组肾透明细胞癌细胞数量柱状图（*P＜0.05）

2.5 沉默lncRNA MALAT1 表达对各组癌细胞凋亡的影响 采用流式细胞术检测实验组、阴性对照组、 正常培养组肾透明细胞癌细胞786-O 的平均凋亡率，与正常培养组（22.456±2.443）%和阴性对照组（21.586±2.285）%相比，实验组的癌细胞凋亡率（80.158±6.181）%明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.05，图6），而阴性对照组细胞凋亡与正常培养组细胞凋亡无明显差异（P＞0.05，图7）。 提示干涉lncRNA MALAT1 的表达能够明显增加肾透明细胞癌细胞786-O 的凋亡。

图6 各组流式细胞细胞检测图

图7 流式细胞仪检测各组肾透明细胞癌细胞凋亡柱状图（*P＜0.05）

3 讨论

RCC 作为致死率最高的泌尿系统恶性肿瘤，每年全世界约有40.3 万新发病例[4]，尽管早期肾癌可以通过手术治疗达到临床治愈， 但是仍有约35%患者表现为晚期或转移性RCC。 伴随高通量测序与生物信息分析技术的飞速发展， 促进我们从遗传学的角度认识和探究RCC 的诊治， 越来越多的研究证明，lncRNA 在RCC 的发生、 发展和预后中扮演重要的角色[5]。

Ji P[6]等在2003 年预测早期非小细胞肺癌的转移时首次发现肺腺癌转移相关转录本1（MALAT1)，在其超保守的3' 端存在一个tRNA 样三叶草的二级结构， 可以被核糖核酸酶P 和Z 识别与切割, 生成近3' 端的短RNA 和两种RNAMALAT1， 剩余的3' 端与RNase Z 结合并剪切,生成一个长度为61nt 的成熟tRNA 样转录本转移至细胞质[7]。多项实验研究证明MALAT1 通过调控选择性剪接、 基因转录、 细胞周期以及充当miRNA的海绵等方式参与恶性肿瘤的发生、发展、转移和预后。

我们通过构建shRNA 载体，沉默非编码RNA MALAT1 在肾透明细胞癌细胞786-O 中的表达，结果发现，下调MALAT1 基因的表达后，肾透明细胞癌细胞786-O 的细胞增殖降低，侵袭能力下降，细胞凋亡增加，提示lncRNA MALAT1 的过表达可能是导致肾透明细胞癌的发生、 发展和转移的重要原因，查阅相关文献，推测MALAT1 可能通过改变mRNAs 前体的选择性剪接[8]；或通过与起始复合体(PRC2)结合，阻止组蛋白甲基化转移酶(EZH2)与HIV-1 长末端重复(LTR)启动子结合，使PRC2所介导的组蛋白无法甲基化[9]；或通过诱导三甲基化的组蛋白3 赖氨酸(H3K9)合成增多[10]，从而达到抑制靶基因的表达，诱发恶性肿瘤的生成。 提示敲除或沉默非编码基因MALAT1 对肿瘤的发生、发展有着明显的抑制作用。 同时MALAT1 可以竞争性地结合miRNA， 使miRNA 与靶基因的结合减少[11]， 而上调MALAT1 的表达可以使得miR-101减少，可以促进癌细胞增殖并减少癌细胞凋亡率[12]。提示敲除非编码基因MALAT1 可能抑制肿瘤的转移和侵袭，改善患者预后。

综上所述，通过沉默lncRNA MALAT1 表达能够抑制癌细胞增殖，降低侵袭，增加凋亡。 其作用机制可能涉及P13K/Akt 信号通路和EZH2/βcatenin 信号通路，以及相关蛋白的表达，在后续的动物实验中将进一步探讨lncRNA MALAT1 在肾细胞癌中的机制研究， 为临床上肾透明细胞癌的诊疗提供新的思路。