杨 洁，李慧素，彭 丽，孟 蕾，张盼盼，吴宁鹏

(河南省兽药饲料监察所，郑州 450008)

氟苯尼考(Florfenicol，FFC)，是80年代后期成功研制的一种动物专用酰胺醇类广谱抗菌药，1990年首次在日本上市，同年在韩国上市，而后相继在挪威、法国、英国、奥地利、墨西哥及西班牙等上市[1]，我国于1999年批准上市。氟苯尼考具有毒性低，对环境污染小，杀菌作用强、不易产生耐药性和其他药物没有交叉耐药性等优点被广泛应用于巴氏杆菌和大肠埃希菌感染，对呼吸道系统感染和肠道感染疗效显著[1-3]。我国至今已批准氟苯尼考子宫注入剂、氟苯尼考可溶性粉、氟苯尼考注射液、氟苯尼考粉、氟苯尼考溶液、氟苯尼考预混剂、氟苯尼考胶囊等7种剂型在牛、猪、鸡、鱼、蚕等动物上使用[4]。仿制药品需选用原研品为参比制剂，但先灵葆雅动物保健公司法国厂生产的氟苯尼考注射液仅批准用于猪，我国兽药典(2020版)批准氟苯尼考注射液可用于猪、鸡和鱼使用，因此，选择河南某公司生产的鸡用氟苯尼考注射液为参比制剂，进行比较药动学试验，考察两种制剂间的差异，以期为实验室自制氟苯尼考注射液工艺优化提供参考。

1 材 料

1.1 仪器与试剂 超高效液相色谱仪(美国Waters公司，Acquity UPLC)；高速冷冻离心机(美国Sigma公司)；pH计(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；IKA MS3 basic漩涡仪(艾卡广州仪器设备有限公司IKA中国))；TTL-DCⅡ型氮吹仪(美国Organomation Associates公司)；Milli-QA10 超纯水仪(美国MiLipore公司)。乙腈(色谱纯，美国Merck公司)；磷酸二氢钾、正己烷、乙酸乙酯(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；

1.2 药品和试剂的配制 氟苯尼考注射液，10 mL∶1 g(实验室自制)。氟苯尼考注射液，10 mL∶1 g，批号：17101701(河南某公司生产)。氟苯尼考对照品(纯度99.1%，批号：K0301703，购自中国兽医药品监察所)。氟苯尼考标准储备液配制：精密称取氟苯尼考对照品10.07 mg，于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配成浓度为1 mg/mL的标准储备液，-20 ℃下保存，有效期为3个月；pH 7.0磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钾0.68 g，加0.1 M NaOH溶液29.1 mL，用水稀释至100 mL；乙腈水饱和的正己烷：向正己烷溶液中加入乙腈水(23∶77)即可。

2 方 法

2.1 试验动物 选择体重约1.83±0.24 kg的健康黄羽肉鸡30只，公母各半，购自鹤壁市永达食品有限公司，常规饲养，自由饮水和采食，饲料为不含抗菌药物的全价日粮。

2.2 试验设计和给药方案 30只鸡随机分为两组，每组各15只。给药时以氟苯尼考计，均按照20 mg/kg bw的剂量单剂量肌内注射给药。

2.3 血样采集 给药前禁食12 h，给药4 h后恢复正常饮食。鸡采用侧卧方式保定，用2.5 mL注射器翼下静脉采血。分别在给药前及给药后0.167、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24、48 h采血，每次采血约1.5 mL，置于含有肝素钠的离心管中，4000 r/min离心10 min取上层血浆，-20 ℃保存。

2.4 检测条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相：乙腈：水(23∶77)；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：223 nm；进样量：10 μL。

2.5 血浆样品前处理 血浆样品自然解冻后，取血浆500 μL于离心管中，加入500 μL pH 7.0磷酸盐缓冲液，混匀后再加入2 mL乙酸乙酯，涡旋1 min，以10000 r/min离心10 min，吸取全部上清液于15 mL离心管中，用乙酸乙酯重复提取1次，合并有机相，于40 ℃水浴氮气吹干，用0.5 mL流动相复溶，混匀后再加0.5 mL乙腈水饱和的正己烷，涡旋混匀，6000 r/min离心10 min，吸取下层澄清液体。过0.22 μm滤膜过滤，供超高效液相色谱仪测定。

2.6 方法学

2.6.1 特异性 取空白血浆、待测血浆样品，按2.5项血浆样品前处理后和浓度2.5 μg/mL 氟苯尼考对照品同时上机检测，观察出峰附近有无干扰。

2.6.2 标准曲线 取7份空白血浆样品，按2.5项血浆样品前处理下操作至氮气吹干，准确移取0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10 μg/mL 氟苯尼考系列浓度各0.5 mL，溶解残余物。上机检测，以药物浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，求回归方程和相关系数。

2.6.3 检测限和定量限 取空白血浆样品，进行不同浓度的添加回收试验，按2.5项血浆样品前处理处理样品，再按2.4项检测条件分析测定，依照信噪比S/N≥3为检测限(Limit of detection，LOD)，S/N≥10为定量限(Limit of quantification，LOQ)。

2.6.4 准确度与精密度 取空白血浆，配制成0.1、2、4、8 μg/mL四个添加浓度的氟苯尼考溶液，每个浓度5个平行样品，共做3个批次，按2.5项血浆样品前处理方法处理样品，再按2.4项检测条件分析测定。

2.6.5 稳定性 取空白血浆，配制成0.1、2、4、8 μg/mL四个添加浓度的氟苯尼考血浆样品，分别置于4 ℃下放置48 h，-20 ℃条件下存放30 d，反复冻融3次后，按2.5项血浆样品前处理方法处理样品，再按2.4项检测条件分析测定，考察样品放置稳定性。

2.7 数据分析 根据UPLC-UV分析所得血药浓度，用WinNonlin 8.1药代动力学软件进行非房室模型计算各组药代动力学参数，SPSS 20.0比较药动学参数的差异显著性，并用GraphPad Prism 6.0制作药时曲线图。

3 结果与分析

3.1 方法学结果

3.1.1 特异性 在本试验条件下测得氟苯尼考的保留时间为2.7 min，血浆样品中氟苯尼考与血浆杂质峰分离效果较好，峰形良好，血浆中其它物质对氟苯尼考的测定无干扰(图1)。

A：空白血浆色谱图；B：氟苯尼考血浆样品色谱图；C：氟苯尼考对照品色谱图(std 2.5 μg/mL)；A：Chromatogram of the blank plasma；B：Chromatogram of florfenicol plasma sample；C：Chromatogram of florfenicol(std 2.5 μg/mL)；图1 氟苯尼考色谱图Fig 1 Chromatogram of florfenicol

3.1.2 标准曲线 在0.1～10.0 μg/mL浓度范围内，氟苯尼考色谱峰面积与浓度呈线性相关，回归方程为y=83443x-279.5，r=0.9999，呈良好的线性关系，符合分析要求。

3.1.3 检测限和定量限 依照信噪比S/N≥3为检测限，S/N≥10为定量限，氟苯尼考在血浆中的检测限为0.05 μg/mL，定量限为0.1 μg/mL。

3.1.4 准确度与精密度 空白血浆添加样品在0.1～8 μg/mL范围内，平均回收率在93.2%～97.1%之间，批内、批间变异系数在1.4%～6.2%之间，回收率稳定，适用于鸡血浆样品中氟苯尼考的测定，具体见表1。

表1 鸡血浆中氟苯尼考血药浓度方法回收率及精密度Tab 1 Florfenicol result of recovery test in chicken plasma

3.1.5 稳定性 氟苯尼考血浆样品分别在4 ℃下放置48 h，-20 ℃条件下存放30 d，反复冻融3次后，检测结果表明，平均回收率在92.1%～97.5%之间，变异系数在1.7%～5.2%之间，稳定性保持良好，具体结果见表2。

表2 血浆样品稳定性结果Tab 2 results of plasma sample stability

3.2 药动学特征 鸡单剂量(20 mg/kg bw)肌内注射氟苯尼考参比制剂和受试制剂后，两种制剂的平均血药浓度见表3，主要药代动力学参数见表4，不同时间测得的平均血药浓度-时间曲线见图2。

表3 两种制剂的平均血药浓度(μg/mL)Tab 3 Mean plasma concentrations of the two preparations

表4 两种制剂的主要药代动力学参数Tab 4 Main pharmacokinetic parameters of the two preparations

图2 两种制剂的平均药时曲线图Fig 2 Mean plasm concentration-time curves of two preparations

4 讨 论

4.1 前处理方法的优化 血浆中氟苯尼考的提取，大多采用乙腈[5-7]、乙酸乙酯[8-11]或pH 7.0磷酸盐缓冲液和乙酸乙酯[12-14]等作为提取液，本文分别比较了三者的区别，发现乙酸乙酯比乙腈的回收率高，可达到86%以上，但当先加pH 7.0磷酸盐缓冲液，再加乙酸乙酯时，回收率更高，可达到90%以上，因此最终采用磷酸盐和乙酸乙酯组合提取。这可能与0.5%氟苯尼考水溶液pH值为4.5～6.5呈弱酸性，而乙腈主要起沉淀蛋白作用，但磷酸盐缓冲液具有盐平衡缓冲作用，乙酸乙酯能从水溶液中有效萃取氟苯尼考有关[15]。样品用流动相复容后，发现溶液比较浑浊，又加入乙腈水饱和正己烷进一步除脂，溶液澄清且能更好的溶解上机检测。

4.2 药动学特征 氟苯尼考在鸡体内的药动学研究报道较多，刘芳等[11]报道鸡分别内服15 mg/kg bw的10%氟苯尼考粉和19.91%氟苯尼考粉后，Cmax分别为5.11 μg/mL和5.78 μg/mL，Tmax分别为1.90 h和0.60 h，t1/2分别为7.51 h和9.16 h，MRT为5.69 h和4.36 h，AUC0→t分别为25.749(μg/mL)h和26.47(μg/mL)h；Ehab等[16]报道鸡内服20 mg/kg bw两种10%氟苯尼考口服液后，Cmax分别为9.02 μg/mL和9.20 μg/mL，Tmax分别为1.02 h和1.05 h，t1/2分别为1.41 h和1.35 h，MRT为2.72 h和2.62 h，AUC0→t分别为26.45(μg/mL)h和26.06(μg/mL)h；Liu Y等[6]报道4周龄肉鸡内服20 mg/kg bw氟苯尼考后，Cmax为3.87 μg/mL，Tmax为0.63 h，t1/2为3.27 h，MRT为16.96 h，AUC0→t分别为8.58(μg/mL)h；Husamettin等[13]报道鸡内服40 mg/kg bw氟苯尼考溶液后，Cmax为7.46 μg/mL，Tmax为1.5 h，AUC0→t为51.95(μg/mL)h；EMA[17]报道肉鸡单次静注54.4 mg/kg bw氟苯尼考注射液后，血清中氟苯尼考浓度从5 min的58.5 μg/mL，到8 h下降到0.069 μg/mL，10 h后未检出，t1/2为0.61 h；本试验鸡单次肌注20 mg/kg bw受试制剂后，t1/2为(3.39±2.65)h，Tmax为(0.66±0.30)h，Cmax为(7.06±2.35)μg/mL，AUC0→t为(19.05±5.79)(μg/mL)h，MRT为(3.25±1.25)h。可以看出，鸡在给药剂量相同，给药方式和药物制剂不同时，Ehab试验达峰浓度和药时曲线下面积最大，Liu Y试验达峰最快，本试验消除半衰期最长；鸡在给药方式相同，给药剂量和药物制剂不同时，Ehab试验鸡内服氟苯尼考口服液达峰浓度最高，刘芳试验内服10%氟苯尼考粉达峰最慢，Husamettin试验鸡内服40 mg/kg bw氟苯尼考溶液药时曲线下面积最大。

在不同动物体内肌注20 mg/kg bw氟苯尼考注射液后：张志娟等[9]报道猪体内Cmax为5.74 μg/mL，Tmax为2.4 h，t1/2为11.78 h，MRT为16.96 h，AUC0→t为85.21(μg/mL)h；Holmes等[18]报道成年羊驼体内Cmax为4.31 μg/mL，Tmax为1 h，t1/2为17.59 h，MRT为21.01 h，AUC0→t为51.83(μg/mL)h；Sheetal等[19]报道山羊体内Cmax为3.07 μg/mL，Tmax为0.5 h，t1/2为0.65 h，MRT为6.24 h，AUC0→t为20.6(μg/mL)h。可以看出，氟苯尼考在不同动物体内，给药剂量和给药方式相同的情况下，鸡体内达峰浓度最高，山羊体内达峰最快，成年羊驼体内消除最慢，猪体内药时曲下面积最大，平均驻留时间最长。

综上所述，鸡单剂量肌内注射20 mg/kg bw受试制剂和参比制剂后，虽然药动学参数无显著性差异(P>0.05)，但相比参比制剂，受试制剂的消除半衰期短，达峰快，达峰浓度低，药时曲线下面积小，平均驻留时间短，相对生物利用度较低，仅为87.55%，两种制剂的工艺可能差异较大。