周蓓烨，李明才，刘 银

（1.宁波大学医学院，浙江 宁波 315211 ；2. 上海市肺科医院检验科，上海200003）

细胞凋亡是指由基因控制的细胞自主有序的死亡。细胞凋亡与增殖之间的动态平衡可保持多细胞动物生长发育的稳定，维持组织器官结构与功能的正常[1]。细胞凋亡的过程受到抑制，导致突变的细胞不能被及时清除是导致肿瘤发生的主要原因。Livin 蛋白是IAP 家族中的一种新的独立于Bcl-2 蛋白的抗凋亡蛋白[2]。正常组织中Livin蛋白的表达水平较低，甚至会检测不到。而在一些肿瘤组织中可存在高水平的Livin 蛋白表达。在细胞凋亡的过程中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）在执行最终的凋亡效应中起到非常重要的作用[3]。Bcl-2 家族中的Bcl-2 是一种编码分子量为24800 的蛋白质原癌基因，具有抑制细胞凋亡的作用[4]。目前关于Livin 蛋白在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达临床上已有大量的报道，但对于Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白这三种蛋白之间的相关性临床上鲜有报道。本文对我院接诊的110 例NSCLC 患者进行研究，旨在探讨Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白在NSCLC 中的表达及意义。

1 资料和方法

1.1 研究资料

本次研究选取的研究对象均为我院接诊的NSCLC 患者（共110 例）。这些患者均经手术病理检查被证实患有NSCLC。其中有男性45 例，女性65 例；其年龄为42 ～73 岁，平均年龄（65.28±5.15）岁。其中有肺鳞癌患者51 例，肺腺癌患者59 例；有高分化肺鳞癌患者17 例，中分化肺鳞癌患者22 例，低分化肺鳞癌患者12 例；有高分化肺腺癌患者32 例，低分化肺腺癌患者27 例（根据WHO《肺肿瘤组织学分型》（2000年版）[5]进行分型）。其中TNM 分期为Ⅰ期或Ⅱ期的患者有57 例，为Ⅲ期或Ⅳ期的患者有53 例（依据1997 年国际抗癌联盟（UICC）规定的TNM 分期方法[6]进行分期）；其中有淋巴结转移的患者有50 例，无淋巴结转移的患者有60 例。

1.2 方法

取上述患者中60 例患者的癌组织、35 例患者的癌旁组织和15 例患者的正常肺组织进行Livin蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白表达水平的检测（采用免疫组织化学法），具体的检测方法是：用10% 甲醛溶液固定样本组织，采用石蜡包埋法将其制成3 ～4μm 厚的切片，然后对切片进行Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白的免疫组织化学染色和HE 染色[7]。所用试剂包括兔抗人Livin 多克隆抗体、兔抗人Caspase-3 多克隆抗体和兔抗人Bcl-2 多克隆抗体（美国SantaCruz公司），超敏SP 试剂盒和DAB 显色剂（北京中山生物有限公司）。根据试剂盒说明书进行实验操作，以阳性切片作为阳性对照，以正常兔IgG 代替一抗作为阴性对照。上述三种多克隆抗体以1:75 的比例进行稀释，依次进行石蜡包埋、切片、脱蜡、水化处理，孵育前置柠檬酸缓冲液进行高压修复约90 s。用3%H2O2去离子水阻断内源性过氧化物酶，切片孵育10min。观察组一抗孵箱内放置90min，对照组则用PBS 替代。进行DAB 显色和苏木素复染，然后进行光镜观察。

1.3 观察指标

上述三种蛋白的阳性反应均表现为胞浆内出现淡黄色至棕黄色颗粒，未见核表达。每张切片计数1000 个细胞，以染色强度和阳性细胞百分率为依据对三种蛋白的染色情况进行评价。首先按细胞染色强度进行评分：无着色为0 分，浅黄色（弱阳性）为1 分，棕黄色（中度阳性）为2分，棕褐色（强阳性）为3 分。然后按阳性细胞百分率进行评分：无阳性细胞为0 分，阳性细胞占比＜25% 为1 分，阳性细胞占25% ～50% 为2 分，阳性细胞占51% ～75% 为3 分，阳性细胞占76%～100%为4 分。上述2 项评分的乘积＞3分则判为阳性。

1.4 统计学方法

运用SPSS 10.0 软件进行统计学分析，n ≥40 且T ≥5 时两样本率比较采用χ² 检验，n ＜40 或T ＜5 时两样本率比较采用Finisher 确切概率法，采用Spearman 等级相关分析法进行相关性分析，以α=0.05 为检验标准。用COX 比例风险模型分析Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白的表达与肿瘤组织类型、分化程度、淋巴结转移情况的关系。

2 结果

2.1 Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白在癌组织、癌旁组织和正常肺组织中的表达

Livin 蛋白和Bcl-2 蛋白在癌组织中表达的阳性率分别为84.59%、69.64%，在癌旁组织中表达的阳性率分别为2.87%、2.26%，在正常肺组织中表达的阳性率分别为0.00%、0.00%。Livin蛋白和Bcl-2 蛋白在癌组织中表达的阳性率均显著高于癌旁组织和正常肺组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Caspase-3 蛋白在癌组织中表达的阳性率为42.57%，在癌旁组织中表达的阳性率为68.32%，在正常肺组织中表达的阳性率为83.19%。Caspase-3 蛋白在癌组织中表达的阳性率显著低于癌旁组织和正常肺组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

2.2 110 例NSCLC 患者Livin 蛋白、Caspase-3蛋白和Bcl-2 蛋白的阳性表达情况与其临床病理特征的关系

110 例NSCLC 患 者Livin 蛋 白 的 阳 性 表达情况与其肿瘤的分化程度、组织学类型无关（P＞0.05），与其淋巴结转移情况有关（P＜0.05）。110 例NSCLC 患者Caspase-3 蛋白的阳性表达情况和Bcl-2 蛋白的阳性表达情况与其肿瘤的分化程度、淋巴结转移情况有关（P＜0.05），与其肿瘤的组织学类型无关（P＞0.05）。详见表2。

表1Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白在癌组织、癌旁组织和正常肺组织中的表达[ 例（%）]

表2 110 例NSCLC 患者Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白的阳性表达情况与其临床病理特征的关系（例）

2.3 110 例NSCLC 患者Bcl-2 蛋白、Livin 蛋白与Caspase-3 蛋白表达水平的相关性

进行Spearman 相关性分析的结果显示，110例NSCLC 患者Bcl-2 蛋白的表达水平与其Livin蛋白的表达水平呈正相关，其Caspase-3 蛋白的表达水平与其Livin 蛋白的表达水平呈负相关。

3 讨论

细胞凋亡（apoptosis）是一种由凋亡相关基因调控的为维护内环境稳定而出现的细胞自身程序化死亡[1]。机体通过细胞凋亡这一途径可保持细胞数量的稳定、维持组织器官中凋亡与增殖细胞之间的动态平衡。细胞内源性基因、酶类都可以对细胞凋亡过程进行调控[8]。有研究表明，恶性肿瘤的发生发展不仅与原癌基因失活和癌基因激活有关，也与细胞凋亡和细胞增殖的异常有密切关系。细胞凋亡功能的损害是肿瘤发生发展的关键原因之一[9]。Livin 蛋白是IAP 家族中一类新的独立于Bcl-2 蛋白的抗凋亡蛋白。Losis Miller等首次在杆状病毒CpGV 和OP MNV 中发现了Livin 蛋白[10]。有研究指出，Livin 蛋白可通过多种途径抗细胞凋亡[11]。相关的研究显示，Bcl-2蛋白可抑制细胞凋亡[12]，延长细胞的生存时间，增加基因突变细胞的数量，并协助细胞逃避免疫系统的监视，从而可促进肿瘤的发生、发展[13]。本研究中发现Bcl-2 蛋白在NSCLC 癌组织中的表达水平明显高于正常肺组织。这可能是由于Bcl-2蛋白通过抑制细胞凋亡促进了NSCLC 的发生、发展[14]。Caspase-3 属于半胱氨酸蛋白酶Caspase家族，Caspase-3 介导的信号传导途径可触发细胞凋亡。本研究中发现Caspase-3 蛋白在NSCLC癌组织中的表达水平明显低于正常肺组织。这提示，NSCLC 的发生、发展可能与Caspase-3 蛋白的表达水平密切相关[15]。本研究的结果显示，110 例NSCLC 患者Livin 蛋白的阳性表达情况与其肿瘤的分化程度、组织学类型无关（P＞0.05），与其淋巴结转移情况有关（P＜0.05）。110 例NSCLC 患者Caspase-3 蛋白的阳性表达情况和Bcl-2 蛋白的阳性表达情况与其肿瘤的分化程度、淋巴结转移情况有关（P＜0.05），与其肿瘤的组织学类型无关（P＞0.05）。进行Spearman 相关性分析的结果显示，110 例NSCLC 患者Bcl-2 蛋白的表达水平与其Livin 蛋白的表达水平呈正相关，其Caspase-3 蛋白的表达水平与其Livin 蛋白的表达水平呈负相关。

综上所述，Livin 蛋白、Bcl-2 蛋白在NSCLC癌组织中存在表达上调的情况，Livin 蛋白的表达与Caspase-3 蛋白、Bcl-2 蛋白的表达密切相关，三者在NSCLC 的发生发展中可能起协同作用。本研究的研究指标和样本量有限，上述研究结论仍需通过进行大样本的临床研究加以证实。