王 娟，张巧琳，龚 彬，杨婷婷, 王 芳，王 成

(1. 重庆市血液中心检验科，重庆 400015；2. 重庆市巴南区妇幼保健院检验科，重庆 401320；3. 奥斯邦有限公司，山东 烟台 264000)

近年来，随着全自动加样系统的广泛应用，微量检测样本漏加或重复加样事件的发生逐渐减少，但仍未完全杜绝[1-4]。为防止全自动化检测过程中检测样本漏加及加样量不准的发生，采供血机构实验室、设备厂家、试剂厂家都在积极地探讨并采取各种措施，但仍未从根本上解决这一问题。比色法作为一种定量分析方法，可通过比较或测量有色化合物的颜色深度来确定待测组分的含量。有研究指出，利用此方法可有效监测酶免实验样本及试剂的添加情况[5-6]。ELISA 是国内采供血机构对经血传播疾病进行筛查的主要手段。索林乙肝抗原诊断试剂中添加了有色化合物，具备利用比色法来进行添加监测的基础。我国是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染大国[7-10]。在血液筛查中加强对HBV 的筛查具有重要的意义。在本文中，笔者主要是利用比色原理进行索林Murex HBsAg Version 3 乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂及相关样本加样过程的吸光度(0ptical DeInsit，OD) 值监控，旨在杜绝漏加事件的发生。

1 材料与方法

1.1 实验材料与工具

本中心无脂血、溶血的献血标本1406 份；3个批次的索林乙肝表面抗原诊断试剂盒，批号分别 为D803110、D845110、D866910 ；Hamilton-Star 移液工作站（Hamilton，瑞士）；全自动后处理系统FAME 全自动酶免分析仪（澳斯邦，瑞士）；酶免过程监控软件。

1.2 方法

检测方法：严格按照索林乙肝表面抗原诊断试剂盒说明书进行操作，首先计算使用足量样品稀释液加上样本在570 nm/620 nm 波长下的OD值；然后取样本稀释液加入样本后读数的中值，以确保设定的范围能够覆盖所有的实验结果。将未加入样本的孔排除。同样的原理也适用于酶结合物的监测阶段。计算酶结合物490 nm/690 nm 波长下的OD 值及底物液在490 nm 波长下的OD 值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 样本及试剂的比色监控数据

3 个批次的试剂加标本后在620 nm/690 nm波长下的平均OD 值分别为0.637、0.616、0.679，加酶后在492 nm/690 nm 波长下的平均OD 值分别为0.915、0.883、0.885，加显色剂后在492 nm波长下的平均OD 值分别为0.145、0.147、0.145。详见表1 ～表3。

表1 样本及试剂的比色监控数据（批号D803110）

表3 样本及试剂的比色监控数据（批号D866910）

表2 样本及试剂的比色监控数据（批号D845110）

2.2 样本及试剂加样过程比色监控OD 值的确定

对3 个批次试剂加标本后在620 nm/690 nm波长下的平均OD 值采用SNK-q 检验进行两两比较的结果显示，D845110、D803110 加标本后在620 nm/690 nm 波长下的平均OD 值处于同一子集中，差异无统计学意义（P＞0.05）；D866910与上述两批次的试剂加标本后在620 nm/690 nm波长下的平均OD 值处于不同的子集，差异有统 计 学 意 义（P＜0.05）。因 此，取D845110、D803110 两批次试剂加标本后在620 nm/690 nm波长下平均OD 值的中位数0.626 作为相应的监控OD 值。对3 个批次试剂加酶后在492 nm/690 nm波长下的平均OD 值采用SNK-q 检验进行两两比较的结果显示，D845110、D869110 加酶后在492 nm/690 nm 波长下的平均OD 值处于同一子集中，差异无统计学意义（P＞0.05）；D803110 与上述两批次的试剂加酶后在492 nm/690 nm 波长下的平均OD 值处于不同的子集，差异有统计学意义（P＜0.05）。因此，取D845110、D869110两批次试剂加酶后在492 nm/690 nm 波长下平均OD 值的中位数0.881 作为相应的监控OD 值，以确保设定的范围能够覆盖所有的实验结果。对3个批次试剂加显色剂后在492 nm 波长下的平均OD 值采用SNK-q 检验进行两两比较的结果显示，3 个批次试剂加显色剂后在492 nm 波长下的平均OD 值均处于同一子集中，差异无统计学意义（P＞0.05）。因此，取3 个批次试剂加显色剂后在492 nm 波长下平均OD 值的中位数0.145 作为相应的监控OD 值。

2.3 对样本及试剂加样过程进行比色监控的方法

使用监控软件对样本及试剂加样过程进行比色监控，如实验过程中出现OD 值低于下限的情况，软件会报警提示加样量不足。详见图1。

图1 样本及试剂加样过程比色监控软件的报警提示界面

3 讨论

目前，我国现存HBV 感染者约有7000 万例[11-12]。输血传播是一种重要的HBV 传播途径。进行严格的血液HBV 筛查对保障输血安全而言至关重要[13-15]。目前，大多血站都使用高灵敏度和高特异度的ELISA 试剂及全自动的仪器进行血液HBV 筛查。但有研究发现，使用全自动检测设备进行ELISA 实验时自动加样系统受多种因素的影响可能会出现加样偏差，严重时甚至会出现漏加样现象[16]。有研究表明，加样误差可在不同程度上影响检测结果的准确性[17-20]。监控ELISA 实验过程中样本及试剂加样量的准确性具有十分重要的意义。本研究创新性地提出利用比色法对全自动加样仪及酶联后处理加样过程进行主动监控，这样不仅可完全代替人员观察，还能反映出各个酶标板孔加样过程中的所有情况。本实验共收集1406 份血液标本，根据酶联免疫试剂盒说明书进行样本和试剂的添加，共采用3 个批次的试剂进行了比色验证，得出足量样品稀释液加上样本在570 nm/620 nm 波长下的OD 值应该大于0.626（未达到表明稀释液或样本加样不足），酶结合物在490 nm/690 nm 波长下的OD 值应该大于0.881（未达到表明加酶量不足），底物液在490 nm 波长下的OD 值应该大于0.145（未达到表明显色液添加不足）。这与相关研究的结果相符[21-22]。本研究中不仅进行了索林乙肝诊断试剂及样本加样比色验证实验，还创新性地提出通过酶标仪比色监测OD 值的变化，进而对整个ELISA 实验进行监控的思路，并设计了监控软件（软件设计思路见图2）。监控软件可对ELISA 实验过程中的3 次比色结果进行抓取，并与实验得出的准确值进行比对。将其与实验室(LIS) 系统相连后可将数据汇总给LIS。LIS 统计数据后，可对异常值进行预警，从而可真正做到对检测全过程进行监控并记录。对于各读数结果未达到临界值的检测，可自动判断其结果无效。这对于提高血液HBV 的筛查质量，保证输血安全具有重要的意义。

图2 比色监控软件设计思路