林木平，黄振华

（深圳市宝安区中心医院，广东 深圳 518102）

肝癌作为临床上常见的恶性肿瘤，具有较高的发病率及转移率。此病患者的预后较差。早期肝癌患者多通过外科手术将肿瘤切除。但多数肝癌患者的临床表现不典型，其病情极易被忽视，在得到确诊时多已发展至中晚期，错失了最佳的治疗时机[1]。晚期肝癌患者肿瘤的手术切除率仅有20% 左右，且其预后欠佳，生存率较低。近年来随着我国医疗水平的提高，放化疗、靶向治疗、免疫治疗及纳米治疗等被相继提出，在晚期肝癌的治疗中取得了较好的效果[2]。人体的正常细胞通过恶变可转变为肿瘤细胞。P53 是人体内重要的抑癌基因，可通过直接或间接作用促使细胞凋亡，从而可防止癌变的发生。miR-139-5p 不仅能与DNA 结合参与基因转录过程的调控，还能起到反式激活的作用，因此miR-139-5p 在调控细胞周期、加速细胞凋亡等多方面作用突出。虽然现阶段临床上对肝癌发生发展的机制进行了大量的研究，亦取得了一定的成效，但尚未达到预期，仍需进行更为深入的研究。本文主要是探讨miR-139-5p 靶向转化生长因子-β1（TGF-β1）抑制肝癌细胞侵袭、转移的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本文的研究对象是近年来在我院进行手术治疗的30 例原发性肝癌患者。其纳入标准是：病情符合原发性肝癌的诊断标准，且经病理学检查得到确诊；首次发病；通过手术将肿瘤切除；术前未接受过其他抗肿瘤治疗；自愿参与本研究，并签署了知情同意书。在这些患者中，有男性24例，女性6 例；其年龄为34 ～75 岁，平均年龄为（57.69±5.43）岁；其中，肿瘤TNM 分期为Ⅰ期和Ⅱ期的患者有17 例，为Ⅲ期和Ⅳ期的患者有13 例；肝癌组织学分类为腺癌、鳞状细胞癌（鳞癌）、腺鳞癌的患者分别有15 例、12 例、3 例。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集与处理 分别采集30 例患者和健康体检者的空腹静脉血4 mL，迅速注入EDTA采血管中，轻轻混匀。在4℃下对血液标本进行10 min 的离心处理（转速为3500 r/min），取上清液，并将其置于-80℃的冰箱中保存待用。

1.2.2 血浆中总RNA 的提取 分别吸取上述血浆样本250 μL，加入750 μL 的Trizol 试剂，混匀后加入氯仿、异丙醇等试剂，按说明书提取总RNA。测定总RNA 纯度合格后用于后续试验。

1.2.3 反转录反应 按照试剂盒的说明书进行反转录反应，将反应后产物cDNA 置于-20℃的冰箱中保存待用。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）合成cDNA 后，用Roche 公司生产的Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）荧 光 定 量PCR 试剂盒来扩增目的基因，U6 为内参基因。血浆miRNA 含量采用相对表达量2- △△Ct 表示。

1.2.5 结果判定 TGF-β1判定：1）阳性细胞染色强度：棕黄色记3 分，黄色记2 分，淡黄色记1 分，无色记0 分。2）阳性细胞数：大于75% 记3 分，介于50%～75%之间记2 分，介于25%～50%（不含50%）之间记1 分，小于25% 记0 分。3）上述两项结果之和：6 分记（+++），4 ～5 分记（++），（++）与（+++）考虑为高表达；2 ～3 分记（+），0 ～1 分记（-），（-）和（+）考虑为低表达。

1.3 观察指标

比较TGF-β1在肝癌组织和癌旁组织中的阳性表达率。观察肝癌组织与癌旁组织中miR-139-5p、TGF-β1的表达情况。

1.4 统计学方法

用SPSS 22.0 软件处理本研究中的数据，符合正态分布的计量资料（本研究中所有计量资料均符合正态分布）用±s表示，用t检验；计数资料用% 表示，用χ² 检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF-β1 在肝癌组织和癌旁组织中的阳性表达率

30 例患者肝癌组织中TGF-β1的阳性表达率为83.33%，其癌旁组织中TGF-β1的阳性表达率为13.33%，二者相比差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1 TGF-β1 在肝癌组织和癌旁组织中的阳性表达率[例（%）]

2.2 肝癌组织与癌旁组织中miR-139-5p、TGF-β1 的表达情况

miR-139-5p 在癌旁组织中呈高表达，在肝癌组织中呈低表达， 差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图1。TGF-β1在肝癌组织中呈高表达，在癌旁组织中呈低表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图2、图3。

图1 miR-139-5p 的相对值

图2 TGF-β1 的表达水平

图3 TGF-β1 的相对灰度值

3 讨论

肝癌是一种发病率较高的消化系统恶性肿瘤。早期肝癌患者通常无特异性症状，中晚期肝癌患者随着肿瘤的快速生长及肝包膜的逐渐扩增，可出现肝区疼痛（主要为刺痛、持续性钝痛）、腹胀、纳差、乏力、消瘦、腹部包块等症状。研究指出，肝癌患者在出现典型的肝区疼痛症状时多已失去了最佳的治疗时机，其病灶完全切除率不足30%[3]。肿瘤转移是一个非常复杂的动态变化过程，常涉及相关基因的异常表达及诸多信号通路的改变。肝脏是人体合成和分泌TGF-β1的主要器官。TGF-β1是一种生物介质，具有调节细胞生长、增殖和分化等多种功能，在肝损伤的发生发展中发挥着重要作用。研究指出，在肝炎病毒或炎症反应的反复刺激下，TGF-β1的水平可显著升高。TGF-β1可通过增加肿瘤细胞与细胞外基质的相互作用，导致转录因子和相关基因共同被激活，同时减少胶原酶、基质纤溶酶等胞外基质酶的生成，诱导肿瘤细胞发生上皮- 间叶转化（EMT），促进成纤维细胞等产生胞外基质蛋白和细胞粘附蛋白，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。本研究的结果显示，30 例患者肝癌组织中TGF-β1的阳性表达率为83.33%，其癌旁组织中TGF-β1的阳性表达率为13.33%，二者相比差异有统计学意义（P＜0.05）。这充分证实了TGF-β1与肝癌的发生、发展密切相关。miRNAs是长度为20 ～25 个核苷酸，其在动植物中起着重要的基因调节作用，是非编码RNA 家族的关键成员。miRNAs 对靶mRNA 的调控主要是通过与其3’端非编码区域（3’-UTR）结合实现的。成熟miRNA 的形成经历了一系列复杂的过程。首先，miRNA 被核内的RNA 聚合酶Ⅱ转录成初级miRNA（pri-miR-NAs），随后RNase Ⅲ型内切酶drosha 再次切割pri-miRNAs，从而产生具有约70 个核苷酸和茎环结构的前体miRNAs（Pre-miRNAs）。Exportin-5 将Pre-miRNAs 从细胞核转运到细胞质后，经RNase Ⅲ型内切酶Dicer 处理产生带有两条链的miR-NA 蛋白复合物，其中一条链将发展为成熟的miRNA，与RNA介导的沉默复合物（RISC）结合，并以目标mRNAs的3’-UTR 为靶点，调控基因转录后的表达。研究发现，miR-139-5p 与多种恶性肿瘤的发生、发展有关。miR-139-5p 可进行染色质修饰并沉默多个靶基因的表达是通过对多梳蛋白抑制复合体 2 （PRC2）的募集实现的。随着肝硬化向肝癌的进展，miR-139-5p 可调控其下游的靶基因IGF1R、ROCK2 等，对抑癌因子RBI 的表达起到促进作用，使E 钙粘蛋白从肿瘤细胞处脱落，进而降低了肝癌细胞中HOTAIR 的表达，阻断肿瘤组织中的Notch 信号通路，抑制癌细胞的侵袭和转移。本研究的结果显示，miR-139-5p 在癌旁组织中呈高表达，在肝癌组织中呈低表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。TGF-β1在肝癌组织中呈高表达，在癌旁组织中呈低表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。可见，miR-139-5p 可能通过下调TGF-β1的表达来抑制肝癌细胞的侵袭、转移。