张 敏, 黄 蓉, 段亚君, 杨潇潇, 余茂耘

(1.合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601; 2.重大疾病代谢及营养调控安徽普通高校重点实验室,安徽 合肥 230601; 3.皖西学院 生物与制药工程学院,安徽 六安 237012)

脱发是临床中较为常见的一种皮肤疾病,其发病率逐年上升,较难治愈,并呈年轻化趋势发展,正在困扰着越来越多人的生活[1]。虽然脱发不会对患者的身体健康产生影响,但对生活质量和心理健康均存在着较为严重的负面作用[2]。因此治疗脱发药物研究备受关注。脱发的类型有多种,常见的有斑秃和雄激素性脱发,脱发多与自身免疫以及毛囊微型化相关,但是具体的发病机制目前尚不明确[3]。目前临床用于治疗脱发的药物主要有米诺地尔和非那雄胺,虽然对脱发有一定治疗作用,但其治疗作用是暂时的,并且伴有皮肤瘙痒、抑郁和性功能障碍等不良反应,因此开发安全有效的毛发生长促进剂成为研究的热点[4-5]。

石斛属是兰科大属,在我国作为民间药物至今已有2 300多年的历史[6],本研究所采用的霍山石斛于2020年正式纳入《中华人民共和国药典》,其中包括金钗石斛、霍山石斛和鼓槌石斛等。石斛中主要含有多糖、生物碱、氨基酸、酚、类黄酮等多种有效成分[7],具有促进血管生成、保护神经、调节血糖、增强免疫力等功效[8]。但石斛对于脱发的作用机制尚不明确。本实验通过脱毛建立小鼠脱发模型,观察霍山石斛对小鼠毛发生长的作用,并分析其治疗脱发的机制,为治疗脱发药物的研发提供参考。

1 仪器与材料

1.1 实验动物

6～8周龄SPF级C57BL/6J小鼠(体质量为20～30 g),购于北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证号为SCXK(京)2016-0011。实验动物饲养于SPF级小鼠饲养室,动物实验遵循合肥工业大学实验动物道德伦理委员会的相关规定。

1.2 药物与试剂

霍山石斛由安徽同济生生物科技有限公司提供。实验所用霍山石斛榨汁液为新鲜霍山石斛10 g,加入50 mL纯净水榨汁所得,现榨现用;H&E染液购于北京兰杰柯科技有限公司;TRIzol试剂购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司;反转录试剂盒购于南京维诺赞生物科技有限公司;免疫组化试剂盒购于美国Abcam公司;Ki-67兔多克隆抗体、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)兔多克隆抗体、微管相关蛋白1轻链3-β(LC3Ⅱ)兔多克隆抗体、转换生长因子-β1(TGF-β1)兔多克隆抗体,均购于美国Proteintech公司;GAPDH鼠单克隆抗体、β-actin兔单克隆抗体,均购于中国ABclonal;p62鼠单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要仪器

组织自动脱水机、石蜡包埋机、冷台、石蜡切片机均购于德国徕卡公司;SCIENTZ48高通量组织研磨器购于宁波新芝生物科技股份有限公司;酶标仪购于美国Bio Tek公司;凝胶成像仪购于上海勤翔科学仪器有限公司; LightCycler 96实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪购于瑞士Roche公司。

2 实验方法

2.1 动物造模、分组及给药

小鼠随机分为对照组和霍山石斛组,每组5只。小鼠用4%水合氯醛麻醉后,用小鼠剃毛器剃去其背部2 cm×3 cm面积的毛发构建脱发模型。对照组不作任何处理,霍山石斛组每天涂抹0.2 mL质量浓度为0.2 g/mL的新鲜石斛汁,共持续14 d。饲养期间自由进食和饮水。

2.2 组织病理学检测

实验结束后,小鼠安乐死,取背部相同位置的皮肤,置于4%的多聚甲醛溶液中,4 ℃固定24 h,脱水机脱水、石蜡包埋,制备厚度为5 μm的石蜡切片,后续用于H&E染色和免疫组化染色。

2.3 实时荧光定量PCR分析

使用TRIzol法提取小鼠背部皮肤组织的总RNA,反转录得cDNA,通过实时荧光定量PCR的方法检测Bcl-2、LC3Ⅱ、p62、TGF-β1的mRNA相对表达量。本实验所用引物序列见表1所列。

表1 引物序列

2.4 Western Blot实验

取皮肤组织约30 mg,加入500 μL组织裂解液后经组织研磨机充分研磨提取组织蛋白,BCA法检测样品蛋白质量浓度,按每孔45 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳,湿法转膜,5%的脱脂牛奶室温封闭1 h,条带采用相应的一抗于4 ℃孵育过夜,然后用PBST洗涤3次,每次8 min,相应二抗孵育1 h,然后用PBST洗3次,每次8 min。滴加ECL显影液于化学发光成像系统中显影。以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值作为该蛋白的相对表达量。

2.5 数据处理

实验数据以(平均值±标准差)表示,使用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析,两样本均数使用t检验,以P<0.05为差异,具有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 霍山石斛对小鼠毛发生长的影响

为了探究霍山石斛对毛发生长的促进作用,在连续给药14 d后,对比各组小鼠背部毛发生长情况,结果如图1所示。从图1可以看出,对照组与霍山石斛组小鼠背部毛发均有生长,与对照组相比,霍山石斛组小鼠背部毛发生长更为明显,毛发更为浓密。结果表明霍山石斛可以促进小鼠背部脱毛区毛发的生长。

图1 霍山石斛促进脱发区毛发生长情况

3.2 霍山石斛对小鼠背部皮肤毛囊形态的影响

为了探究霍山石斛对小鼠皮肤毛囊的影响,将对照组和霍山石斛组小鼠背部皮肤组织切片进行H&E染色,观察对照组与霍山石斛组小鼠背部皮肤的毛囊形态结构,结果如图2所示。从图2可以看出,与对照组相比,霍山石斛组的毛囊密度显著高于对照组,霍山石斛组的毛囊大小显著大于对照组,并且毛囊结构形态更加完整。结果表明,霍山石斛可以增加小鼠背部皮肤的毛囊数量并且改善毛囊形态。

图2 小鼠背部皮肤H&E染色结果

3.3 霍山石斛对小鼠皮肤毛囊生成的影响

Ki-67是增殖细胞核抗原,可以反映细胞增殖情况,是评估细胞增殖活性的重要标志物。为了探究霍山石斛是否可以加速毛囊的形成,本实验通过免疫组化染色检测小鼠背部皮肤组织Ki-67的表达水平,结果如图3所示。

从图3可以看出,在对照组和霍山石斛组的小鼠背部皮肤中均能检测出Ki-67的表达,但与对照组相比,霍山石斛组Ki67的表达量显著高于对照组。结果表明，霍山石斛可以促进细胞增殖,加速小鼠背部皮肤毛囊的形成。

图3 小鼠背部皮肤Ki-67表达水平

3.4 霍山石斛对脱发的缓解作用

Bcl-2和Bax是线粒体凋亡途径的重要因子,Bcl-2能够抑制细胞凋亡,而Bax不仅拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用,还会促进凋亡。本文研究表明霍山石斛可以促进毛囊的生长,为探究霍山石斛对毛囊凋亡的影响。本实验通过Western Blot和实时荧光定量PCR对抑制凋亡分子Bcl-2进行检测,结果如图4所示。由图4可知,与对照组对比,霍山石斛组的Bcl-2的蛋白(P<0.05)和mRNA(P<0.01)表达水平显著升高。结果表明,霍山石斛通过促进Bcl-2的表达,抑制凋亡缓解脱发。

图4 抑制凋亡分子Bcl-2的检测结果

3.5 霍山石斛对毛囊活化的促进作用

p62和LC3Ⅱ为自噬标志物,相关研究表明诱导自噬是启动毛囊活化和毛发再生的重要条件[9]。为了明确霍山石斛促进毛囊活化与自噬途径的相关性,本实验检测自噬相关基因的蛋白和mRNA的表达水平,结果如图5所示。由图5可知,与对照组相比,霍山石斛组的LC3Ⅱ蛋白(P<0.05)和mRNA(P<0.05)的表达水平显著升高,而p62的表达未发生明显改变。结果表明,霍山石斛通过促进LC3Ⅱ的表达诱导自噬,进而促进毛囊活化,发挥调控毛发生长的作用。

图5 自噬相关基因的蛋白和mRNA的表达水平

3.6 霍山石斛通过TGF-β1促进毛发生长情况

TGF-β1可以调节细胞的生长和分化,通过抑制TGF-β1可以促进毛囊生长,已有研究表明,中药及其有效成分中常有TGF-β1抑制剂[10]。为探究TGF-β1是否参与到霍山石斛促进毛发生长的过程中,本实验检测小鼠背部皮肤组织中TGF-β1的表达水平,结果如图6所示。由图6可知,与对照组相比,霍山石斛组的TGF-β1的蛋白(P<0.05)和mRNA(P<0.05)表达水平均显著降低。结果表明,霍山石斛可以通过抑制TGF-β1的表达来促进生发。

图6 小鼠背部皮肤组织中TGF-β1的表达水平

4 讨 论

脱发是一种常见的皮肤病,与自身免疫机制、遗传以及内分泌等因素有关,可能与一种或几种细胞因子的缺失或者过表达相关,但是具体的发病机制尚未明确[11-12]。目前临床常用米诺地尔和非那雄胺治疗脱发,但其治疗伴随着许多不良反应。近年来的研究发现,中草药副作用小、靶点多,对于脱发有一定的治疗效果;例如,中草药驱虫斑鸠菊醇提取物能够抵消压力,从而促进毛发生长,鱼腥草、紫苏和绿茶的中药复合物可以体调节IGF1和TGF-β1来刺激毛发生长。这些都表明中草药可以作为研究治疗脱发的新方向[13-14]。

自噬在健康与疾病中起着重要的作用,如适应氧化应激、细胞分化和衰老等。LC3Ⅱ作为经典的自噬标志物,通常在自噬过程中明显上升,用于表明自噬激活。近年来相关研究发现自噬在维持自发生长阶段的毛发生长过程中发挥关键作用,并且激活自噬可以诱导毛囊活化,促进毛发的生长[9]。本文结果显示,霍山石斛能够促进LC3Ⅱ的表达,表明霍山石斛能够通过自噬通路促进毛囊的活化,进而促进生发作用。

本研究结果表明,与对照组相比,用霍山石斛处理的小鼠背部皮肤的毛发生长更为明显,毛囊数目更多,毛囊形态结构更为完整,并且用霍山石斛处理的小鼠背部皮肤组织的自噬激活的LC3Ⅱ和Bcl-2的蛋白和mRNA表达水平显著上升,细胞生长分化相关基因TGF-β1的蛋白和mRNA表达水平显著下降,表明霍山石斛能够促进毛发生长。

综上所述,霍山石斛够通过改善毛囊形态与结构、促进自噬与抑制凋亡发挥促进毛发生长的作用,为脱发药物的开发提供理论依据。