张 进 王 东

(1.首都医科大学附属北京朝阳医院SICU，北京 100020；2.首都医科大学附属北京朝阳医院骨科，北京 100020)

骨折是造成伤残的重要原因。由于骨折愈合过程复杂，虽然严格按照诊疗规范进行骨折复位、固定，仍有约10%的患者出现骨折延迟愈合甚至骨折不愈合[1-3]。一旦患者骨折不愈合，往往需要进行二次手术，即使术后骨折愈合，但患者功能恢复困难，严重影响生活、工作。寻找促进骨折愈合的方法一直是创伤骨科研究的重点[4-6]。

目前直接促进骨折愈合的生物制剂有限。虽然骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)被美国批准用于临床[7]，但易出现异位骨化，有研究[8-9]显示，BMP-2会增加术后内固定物失败，部分患者应用BMP-2后会出现危及生命的并发症。局部高剂量应用BMP-2会有诱发恶性肿瘤的风险[8]。

续断是我国传统中药，《神农本草经》命名为续断并沿用至今。续断又称川断、和尚头，因为可以“续折接骨”所以称之为“续断”。《本草经集注》上记载“广州又有一藤名续断，一名诺藤，断其茎，器承其汁饮之，疗虚损绝伤，用沐头，又长发”[10]。

《植物名实图考》[10]详细描述了续断的形态，并进行绘图备注。描述续断为“滇中生一种续断，极似芥菜，亦多刺，与大蓟类似。稍端夏出一苞，黑刺如毬，大如千日红花苞，开花白，宛如葱花，茎劲，经冬不折，土医习用。滇蜀密布，疑川中贩者即此种，绘之备考，原图俱别存”。又对之前本草记载进行分析，指出之前记载有误。

《滇南本草》中对续断描述为“入肝补肝，强筋骨，走经络，止经中酸痛，安胎，治妇人白带，生新血，破瘀血，落死胎，止咳嗽，咳血，治赤白便浊”[10]。续断促进骨折愈合的研究较多，但是其机制不清，阐明其作用机制，可为临床推广续断治疗骨折以及开发新药物提供研究思路。

本研究采用网络药理学以及分子对接技术对续断促进骨折愈合的机制进行探讨。首先根据数据库分析续断的有效成分以及筛选其治疗骨折的作用基因靶点。然后对基因靶点进行基因本体(gene ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，得到续断促进骨折愈合的重要信号通路。通过对作用基因靶点进行蛋白互作网络分析，得到续断促进骨折愈合的关键基因。最后通过分子对接技术验证续断调控关键基因的机制，以及可能结合的位点。

1 资料与方法

1.1 续断有效成分筛选以及作用靶点获取

通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索续断的化学成分，设定口服药物生物利用度(oral drug bioavailability,OB)≥30%和类药性指数(drug like index, DL)≥0.18作为筛选续断有效活性成分的标准[11]。通过该数据库得到续断有效活性成分的作用靶点，并利用UniProt(https://www.uniprot.org/)数据库将作用靶点名称(target name)转换成基因名称(gene name)。

1.2 续断治疗骨折的作用基因靶点筛选

以骨折“bone fracture”作为关键词，在TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(http://www.omim.org/)、GeneCards(http://www.genecards.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)等数据库进行搜索，获取骨折的相关基因靶点[12-16]。整合上述数据库的骨折靶点，删除重复基因。将续断有效成分的作用基因靶点与骨折的相关基因靶点进行匹配，获取交集。通过EVenn(http://www.ehbio.com/test/venn/#/)软件绘制韦恩图[17]。

1.3 续断治疗骨折的作用基因靶点GO以及KEGG富集分析

将获取的续断治疗骨折的作用基因靶点导入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)数据库，设定种属为人类，进行GO以及KEGG富集分析[18-19]。获取续断治疗骨折的作用基因靶点参与的生物学过程、分子功能、细胞成分、信号通路。

1.4 续断治疗骨折的蛋白互作网络构建以及关键基因筛选

将续断治疗骨折的作用基因靶点导入STRING 11.5(https://www.string-db.org/)数据库[20-21]。设定相互作用最低值为0.4，构建续断治疗骨折的蛋白互作网络，导出.tsv格式文件。将文件导入Cytoscape 3.8.2(https://cytoscape.org/)软件，通过计算网络degree以及betweenness参数，分别选取前5位基因，获取交集得到网络关键基因[22-23]。

1.5 分子对接

将续断治疗骨折的关键基因作为受体，续断中OB前3位有效成分作为配体。通过PDB(http://www.rcsb.org/)数据库查询得到续断治疗骨折的关键基因分子结构，导出.pdb格式文件[24]。通过TCMSP数据库导出续断中OB前3位的有效成分分子结构，导出为.mol2格式文件。将受体分子结构即关键基因分子结构导入Pymol(https://pymol.org/2/)软件，去除水分子和配体结构，得到受体结构[25]。将受体与配体结构导入Autodock 4.2(http://autodock.scripps.edu/downloads)软件进行分子对接并分析得到最低结合能。同时导出.pdbqt格式文件。将文件导入Pymol软件，显示受体与配体结合氢键、结合位点以及确定定活性口袋，并将结果可视化。

2 结果

2.1 续断有效成分以及作用靶点

通过设定OB≥30%和DL≥0.18，得到续断有效成分为8个(表1)，通过TCMSP数据库得到作用靶点63个，删除重复靶点，最终得到作用靶点53个。

表1 续断有效成分

2.2 续断治疗骨折的作用基因靶点筛选

通过TTD、OMIM、GeneCards、DrugBank、PharmGkb等数据库查询骨折相关作用靶点，共得到5 115个相关靶点(图1)。其中TTD与OMIM数据库未查询到与骨折相关靶点。将骨折相关靶点与续断的作用靶点进行匹配，获取交集得到34个续断治疗骨折的作用基因靶点(图2)。

图1 各数据库骨折相关作用基因靶点

图2 续断作用靶点与骨折相关基因靶点交集

2.3 续断治疗骨折的作用基因靶点GO以及KEGG富集分析

通过DAVID数据库，设定参与的效应P值小于0.05，参与的基因至少2个。分析得到续断治疗骨折的作用基因靶点参与的生物学过程有76个，其中前10位为：药物反应、缺乏配体的外部凋亡信号通路、对脂多糖的反应、昼夜节律、对有毒物质的反应、对雌二醇的反应、gamma-氨基丁酸信号通路、线粒体释放细胞色素c、对辐射的反应以及行为恐惧反应等。参与的细胞成分有20个，其中前10位为：胞质、GABA-A受体复合物、突触后、神经元投射、等离子体膜、线粒体外膜、氯离子通道复合体、膜筏、线粒体以及pore复合体等。参与的分子功能有20个，其中前10位为：蛋白质同源二聚化活性、GABA-A受体活性、细胞外配体门控离子通道活性、泛素蛋白连接酶结合、相同蛋白的结合、酶结合、前列腺素-内过氧化物合酶活性、BH3域结合、GABA门控氯离子通道活性以及芳香酯活性等，详见表2。

表2 续断治疗骨折的作用基因靶点GO富集分析结果

KEGG富集分析显示，治疗骨折的作用基因靶点参与的信号通路有44个，其中前10位为：癌症相关信号通路、结直肠癌相关信号通路、激活神经的受体配体结合相关信号通路、吗啡成瘾相关信号通路、雌激素信号通路、内源性大麻素逆行信号通路、脂肪细胞中脂肪分解调节相关信号通路、细胞凋亡信号通路、神经营养蛋白信号通路、乙型肝炎信号通路等，详见表3。

表3 续断治疗骨折的作用基因靶点KEGG富集分析结果

2.4 续断治疗骨折的蛋白互作网络以及关键基因

通过STRING数据库，设定相互作用最低值为0.4，构建续断治疗骨折的蛋白互作网络，共纳入34个基因，79个连接。平均degree参数为4.65，蛋白互作网络富集P值小于1.0e-16(图3)。导入Cytoscape软件，计算degree以及betweenness参数，degree参数前5位基因为：JUN、PTGS2、HSP90AA1、MAPK14、CASP8。betweenness参数前5位基因为：OPRM1、MAPK14、PTGS2、HSP90AA1、PGR。获取交集得到续断治疗骨折的关键基因为PTGS2、HSP90AA1、MAPK14(图4，图中黄色为关键基因)。

图3 续断治疗骨折的蛋白互作网络

图4 续断治疗骨折的关键基因

2.5 分子对接

将续断治疗骨折的关键基因：PTGS2、HSP90AA1、MAPK14作为受体，将续断中OB前3位的有效成分：Gentisin、Sylvestroside Ⅲ_qt、(E，E)-3，5-Di-O-caffeoylquinic acid等作为配体。通过Pymol、Autodock等开源软件进行分子对接，结果显示，各小分子均能与配体进行结合。选取结合能最低值的结合位置进行分析，测量结合氢键距离以及结合位点(表4、图5、图6)。

图5 各配体受体结合位点

图6 各配体受体结合区域

表4 各配体受体最低结合能

3 讨论

续断是我国的传统中药，因为具有“续折接骨”的作用而得名，但其促进骨折愈合的机制不清，最早在《神农本草经》上出现。历代本草典籍中以续断为正名，别名较多，如“属折”、“接骨”、“续断藤”、“接骨木”、“马蓟”、“大蓟”等。根据续断的产地别名又有区别，如贵州、云南称之为“山萝卜”，四川为“川萝卜根”，湖北为“黑老鸦头”、“小续断”等[10]。

历代本草典籍中关于续断的记载又略有不同，其中有些可能是将其他植物误以为是续断。清代《植物名实图考》中对续断进行了详细描述，并进行绘图。并指出之前典籍存在错误，如书中记载“此药习用，并非珍品，不识前人何以未能的识”[10]。表明从清代开始，川续断成为续断的唯一正品来源。

本研究通过网络药理学以及分子对接技术对其作用机制进行探讨。利用在线数据库TCMSP进行检索，按照OB和DL这两个反映药物被吸收利用程度的指标进行筛选，发现续断有效成分共有8个，分别为Gentisin、Sylvestroside Ⅲ_qt、(E，E)-3，5-Di-O-caffeoylquinic acid、Sylvestroside Ⅲ、Japonine、Cauloside A_qt、beta-sitosterol、sitosterol。目前尚无这些化合物调控骨折愈合的研究报道。为此，笔者通过TCMSP数据库继续检索，删除重复作用基因靶点，最终得到上述8种化合物的作用基因靶点53个。将这些作用靶点与骨折愈合相关的基因进行交集分析，发现有34个可能的作用靶点，这些基因为分析续断促进骨折愈合的机制提供了基础。

对基因进行富集分析，发现蛋白质同源二聚化活性、GABA-A受体活性、细胞外配体门控离子通道活性、泛素蛋白连接酶结合、相同蛋白的结合、酶结合、前列腺素-内过氧化物合酶活性、BH3域结合、GABA门控氯离子通道活性以及芳香酯活性等这些分子功能可能是续断调控骨折愈合的重要机制。这些受体以及酶活性是骨折愈合的基础，但是具体调控机制有待进一步研究。

通过STRING数据库构建续断治疗骨折的蛋白互作网络，筛选得到续断治疗骨折的关键基因为PTGS2、HSP90AA1、MAPK14。Kong等[26]分析微重力刺激内皮祖细胞调控骨折愈合的机制，发现微重力促进血管形成可能与MAPK信号通路有关。笔者之前的研究也发现MAPK14基因可能与骨折愈合过程中血管形成有关[1]。激活腺苷受体A2A会上调激活骨折组织内血管内皮细胞MAPK14表达。Camal Ruggieri等[27]总结与骨折愈合相关的信号通路，提出MAPK信号通路激活是机械传导促进骨修复的基础。超声波促进成骨细胞增殖、分化以及骨修复可能与上调MAPK有关。Sharma等[28]分析神经纤维瘤蛋白缺陷小鼠，发现MAPK信号通路过度激活可能是小鼠胫骨骨折不愈合的关键。所以MAPK通路调控骨折愈合的机制复杂，过度激活或者抑制激活可能均会导致骨折不愈合。目前关于PTGS2与骨折愈合的研究较少。陈建泉等[29]通过网络药理学探讨女贞子治疗骨质疏松性骨折的机制，发现PTGS2是参与促进骨折愈合的主要信号通路。现尚未查到有关于HSP90AA1与骨折愈合的报道。

通过分子对接技术，笔者发现续断中OB前3位的有效成分Gentisin、Sylvestroside Ⅲ_qt、(E，E)-3，5-Di-O-caffeoylquinic acid均可以与关键调控基因结合，且最低生物结合能均小于0，表明结合稳定，无需催化剂参与反应，且大部分结合为3个氢键，结合牢固。

本研究在国内外首次采用网络药理学以及分子对接技术分析续断促进骨折愈合的机制，提出其中关键基因靶点以及调控的可能机制。不足之处为采用在线数据库进行分析，需要进一步采用实验加以证实。而且数据库数据实时更新，续断有效成分的作用靶点可能会存在变化。

续断是促进骨折愈合的传统中药，其有效成分有Gentisin、Sylvestroside Ⅲ_qt、(E，E)-3，5-Di-O-caffeoylquinic acid等，促进骨折修复的关键作用靶点为PTGS2、HSP90AA1、MAPK14，且有效成分与关键作用靶点均可以稳定结合。