刘汉雄， 杨小安， 熊潭玮

(1.郴州市第一人民医院消化内科，湖南省郴州市 423001；2.中山大学附属第三医院感染科，广东省广州市 510630)

内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)主要来源于骨髓，并存在于肝脏、脾脏、心肌等多个组织器官中，可直接分化为血管内皮细胞促进血管再生[1]。肝损伤时，骨髓来源的EPC能顺利归巢到受损肝组织[2]，而体外扩增的EPC[3]经肝门静脉或外周静脉输入，也能到达受损肝组织。EPC到达受损肝组织后可分泌多种细胞因子促进肝细胞增殖和肝脏修复[4]。EPC还可以通过血管生成作用修复受损肝组织。Child-Pugh分级为目前临床使用最广泛的肝硬化及肝功能评分标准。但肝硬化患者循环EPC功能及与Child-Pugh评分关系的报道少见，本文对此进行了研究，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选择中山大学附属第三医院2019年1月—2020年1月住院或门诊确诊乙型肝炎肝硬化患者60例为肝硬化组，其中Child-Pugh A、B、C级[5]各20例；另选同期20例健康体检者为对照组。乙型肝炎病毒感染诊断标准：HBsAg阳性或HBV-DNA阳性。对照组研究对象排除乙型肝炎病毒感染(HBsAg阴性且HBV-DNA阴性)。两组基线资料见表1。本研究由本院伦理委员会批准，研究对象均知情同意。

表1 各组临床资料的比较

1.2 循环EPC的分离、培养和计数

抽取静脉外周血加入含Ficoll-Paque人淋巴细胞分离液的离心管上层，4 ℃ 2 200 r/min离心25 min，吸取第二层云雾状单核细胞层，将分离所得单个核细胞重悬于含有20%胎牛血清、50 μg/L血管内皮生长因子的EGM-2培养基中，接种至预先包被好人纤维连接蛋白(1 ng/L)的6孔板中，置于5% CO2、饱和湿度、37 ℃培养箱中培养，每3天换液除去未贴壁细胞，培养至7天后的贴壁细胞即为实验所用EPC。本研究使用DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)和FITC标记的荆豆凝集素-l(FITC-BS-l)双重染色免疫荧光鉴定EPC，Dil-ac-LDL(红色)和FITC-BS-Lectin(绿色)双染色阳性细胞数量即为EPC，计数EPC。

1.3 EPC增殖、迁移能力的测定

原代内皮祖细胞培养7天后，用0.25%胰酶消化贴壁细胞，重悬于DMEM培养液中。将相同数量内皮祖细胞接种到包被有人纤维连接蛋白的96孔培养板，每孔加入10 μL MTT(5 g/L)，培养4 h后弃去上清液，在酶标仪下于波长490 nm处测OD值。调整细胞至2×105个/mL；置入Transwell小室，24 h后取出小室，弃去上层液体，刮去滤膜上的未迁移细胞，4%多聚甲醇溶液固定10 min，以DAPI染色，置于荧光显微镜下观察，选择3个随机视野计数迁移入下室的细胞。

1.4 统计分析

2 结 果

2.1 乙型肝炎肝硬化患者EPC数量的变化

内皮祖细胞的荧光染色鉴定见图1。循环EPC数量乙型肝炎肝硬化早期患者(Child-Pugh A、B级)较对照组增加，且高于Child-Pugh C级患者(P<0.05)；Child-Pugh C级患者较对照组高但差异无显著性(P>0.05；图1)。

图1 乙型肝炎肝硬化患者EPC鉴定和数量的变化荧光染色鉴定Dil-ac-LDL为红色，Lectin为绿色，双染色细胞即为EPC(200×)。a为P<0.05，与对照组和Child-Pugh C组比较；b为P<0.05，与Child-Pugh A组比较。

2.2 乙型肝炎肝硬化患者内皮祖细胞功能变化

Child-Pugh A级、B级、C级患者循环EPC的体外迁移、增殖能力随Child-Pugh分级升高而降低(P<0.05；表2)。

表2 乙型肝炎肝硬化患者内皮祖细胞功能的变化

2.3 循环EPC功能与Chhild评分的相关性

Spearman相关分析发现，循环EPC迁移和增殖能力与Child-Pugh评分均呈明显负相关(P<0.05；图2)。

图2 乙型肝炎肝硬化患者循环EPC功能与Child-Pugh评分的相关性

3 讨 论

本研究发现，乙型肝炎肝硬化早期(Child-Pugh A、B级)患者循环EPC数量较对照组上升，而晚期(Child-Pugh C级)患者EPC数量较对照组轻微上升，较早期却下降；EPC数量与Child-Pugh评分之间没有相关性,而EPC迁移、增殖能力与Child-Pugh评分呈负相关。因此推论，在肝硬化形成以后，随着肝硬化结节的产生，肝小叶正常结构破坏，肝脏微循环系统也受到损伤。这些变化都可能导致门脉高压产生，引起血管内皮损伤和微循环障碍。机体为修复受损的血管内皮，加强从骨髓募集、动员EPC，从而使循环EPC数量增加。该过程可能是机体修复肝损伤及肝纤维化的一种代偿机制。而乙型肝炎肝硬化晚期患者已处于严重耗竭状态，并发腹水、黄疸、肝性脑病等多种并发症，骨髓功能亦受到影响，无法动员足够EPC修复肝脏，导致EPC水平较早期出现下降。这种下降趋势，可能导致微循环障碍难以修复，与肝硬化的进展相互促进。

本结果还显示，乙型肝炎肝硬化患者循环EPC功能呈下降趋势，且随着Child-Pugh评分上升EPC功能下降更为明显。乙型肝炎肝硬化发生后，肝脏功能受到损伤，肝脏代谢功能和合成功能紊乱，导致胆红素升高，脂质代谢异常及各种有毒物质蓄积，导致EPC功能出现障碍。同时，也可能是乙型肝炎肝硬化晚期EPC数量减少，EPC功能障碍，对肝脏血管内皮修复及血管新生造成影响，从而进一步促进了肝硬化的进展。

有研究与本研究结果一致，认为肝硬化患者循环EPC功能降低[6]，EPC数量上升[7]。然而，也有研究认为，肝硬化患者循环EPC数量下降[8-9]，EPC功能增强[10]。本研究认为，不同结果可能与入组病例肝硬化的病因不一致，或者其他研究未对肝硬化严重程度进行分级有关。不同原因肝硬化有不同发病机制，不同肝硬化严重程度患者的肝功能水平不同，并发症不同，导致EPC募集、动员能力及功能必定也会出现改变。本研究入组患者均为乙型肝炎肝硬化患者，且按照国际公认的Child-Pugh分级进行研究，从而减少了研究偏倚。

总之，本研究发现，肝硬化患者循环EPC数量上升，EPC功能降低。以EPC为治疗靶点，提高其数量及功能，有可能达到修复肝损伤及阻止肝硬化恶化的目的。以EPC为靶点的乙型肝炎肝硬化治疗策略，如EPC移植，应该得到重视及进一步的研究。