郑龙蛟， 王志萍

(1.徐州医科大学江苏省麻醉学重点实验室，江苏省徐州市 221009；2.无锡市惠山区人民医院麻醉科，江苏省无锡市 214000；3.徐州医科大学附属医院麻醉科，江苏省徐州市 221000)

全身麻醉联合超声引导下区域神经阻滞能有效降低术中麻醉药物用量，并减少不良反应。局部麻醉药在区域神经阻滞中的作用时间有限，且高剂量容易诱发神经毒性[1]。临床上为延长神经阻滞作用时间，尝试联合肾上腺素及可乐定等其他局部麻醉辅助药物以增强外周神经阻滞效果[2]。右美托咪定通过激活中枢神经α2受体发挥镇静及镇痛作用，且对中枢呼吸抑制程度较小，临床运用广泛[3]。多项研究显示，局部麻醉药联合右美托咪定不但可以提高蛛网膜下腔和硬膜外阻滞效果，也可以延长外周神经阻滞作用时间，加快神经阻滞效果，改善术后镇痛作用[4-5]。本研究分析右美托咪定联合布比卡因对大鼠坐骨神经阻滞效果并探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物及分组

选取SPF级健康成年雄性SD大鼠36只，8～10周龄，体质量180～220 g，由南京中医药大学实验动物中心提供。将其随机分为4组：假手术组(Sham组)、布比卡因组(Bup组)、右美托咪定+布比卡因组(Dex组)和毛喉素+右美托咪定+布比卡因组(Fors组)，每组9只。

所有大鼠均参照文献[6]制备大鼠坐骨神经阻滞模型。吸入2%～3%七氟醚麻醉下，俯卧位固定、备皮、消毒。于股骨内测坐骨神经结节处向远端方向切开皮肤，钝性分离各层肌肉组织，暴露股二头肌，充分暴露坐骨神经及其3个分支。选择坐骨神经周围为注射点，分别对Bup组、Dex组及Fors组大鼠注射0.5%布比卡因0.2 mL、1.0%布比卡因0.1 mL+6 μg/kg右美托咪定0.1 mL、1.0%布比卡因0.1 mL+6 μg/kg右美托咪定0.1 mL+毛喉素0.1 mL。其中Fors组先注射0.1 mL毛喉素，10 min后再注射右美托咪定和布比卡因，其他3组均加入0.1 mL二甲基亚砜(DMSO)注射，Sham组注射0.2 mL生理盐水。注射完毕后逐层缝合切口，并以抗生素消毒伤口预防感染，整个操作过程约10 min。术毕放入饲养笼，分别于大鼠复位反射恢复后按时间点进行指标观察。

1.2 大鼠热刺激缩足反应潜伏期测定

采用KW-RB型智能热板测痛仪(南京卡尔文生物公司)于阻滞前及阻滞后10、20、30、60、120、180、240、300、360 min进行大鼠右后肢热踏板试验，温度55 ℃，按照先左后右顺序交替测定后足热刺激缩足反应潜伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)[7]，每只后肢重复3次，间隔5 min，取平均值。为避免组织损伤，监测时间设定为10 s，如果超过10 s仍然未出现缩足反应，则停止刺激，PWTL记为10 s。计算最大效应百分比(maximum percentage effect，MPE)来反应感觉阻滞程度，其中基础PWTL以阻滞前的PWTL为基线值。MPE(%)=[(给药后PWTL-基础PWTL)/(10-基础PWTL)]×100%。

1.3 大鼠后肢伸姿推力测定

于阻滞前及阻滞后10、20、30、60、90、120、150、180 min进行大鼠后肢伸姿推力(elevated posture thrust，EPT)测定[8]：将大鼠直立上提，保持后肢伸展姿势，以便远端足趾和足尖支撑体质量，置于电子秤上方，大鼠后肢伸展所显示的数值即为EPT(g)。

1.4 免疫组化

坐骨神经阻滞后12 h，取各组大鼠3只，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，4%多聚甲醛灌注大鼠，分离并取L4～L6节段脊髓，经多聚甲醛后浸泡固定24 h，再进行蔗糖梯度脱水后，置入恒冷箱切片机进行冠状冰冻切片(30 μm)，冰冻切片室温晾干15 min后置于含10%正常山羊血清的PBS中室温封闭1 h，SP法免疫组化实验检测环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(phosphorylated cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，p-CREB)和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的表达水平。

1.5 统计学分析

2 结 果2.1 大鼠各时点MPE、EPT的比较

Bup组和Fors组在阻滞后10～180 min，Dex组在阻滞后10～360 min MPE较Sham组明显升高(P<0.05)；Dex组在阻滞后10～360 min MPE较Bup组明显升高(P<0.05)；Fors组在阻滞后的10～360 min MPE较Dex组明显降低(P<0.05；表1)。Bup组在阻滞后10～90 min，Dex组和Fors组在阻滞后10～120 min EPT较Sham组明显降低(P<0.05)；Dex组和Fors组在阻滞后10～120 min EPT较Bup组降低(P<0.05；表2)。

表1 各组大鼠各时点MPE的比较 单位：%

表2 各组大鼠各时点EPT的比较 单位：g

2.2 各组大鼠脊髓cAMP、PKA、p-CREB和BDNF的表达

与Sham组比较，其他3组cAMP、PKA、p-CREB和BDNF的表达水平均下降(P<0.05)；与Bup组比较，Dex组各指标较Bup组降低(P<0.05)；Fors组各指标表达水平较Dex组明显升高(P<0.05；图1)。

图1 各组大鼠脊髓中cAMP、PKA、p-CREB和BDNF蛋白表达水平A为典型免疫组织图(SP法，40×)；B为蛋白表达水平的柱状统计图。a为P<0.05，与Sham组比较；b为P<0.05，与Bup组比较；c为P<0.05，与Dex组比较。

3 讨 论

临床发现单次给予局部麻醉药物产生的神经阻滞时效相对短暂，而穿刺部位连续给药以及增加药物剂量虽然可延长神经阻滞时间，但存在诱发神经毒性和感染等并发症的风险。有报道指出[9-10]，通过联合使用局部麻醉药物佐剂包括阿片类或α2受体激动剂等可以提高中枢神经及周围神经阻滞的效果及延长阻滞时间。Singh等[11]的临床研究发现，右美托咪定联合罗哌卡因可以延长尺神经阻滞的持续时间。而本研究结果显示，相比单独使用布比卡因，右美托咪定联合布比卡因可以延长大鼠坐骨神经阻滞的持续效果和时间，增强镇痛效能。

右美托咪定具有抑制感觉神经元超极化激活环核苷酸门控阳离子(hyperpolarization cyclic nucleotide，HCN)电流的作用，以此降低神经元兴奋性，达到镇痛效果[12]。Parsons等[13]报道，当胞内cAMP水平增加时，可直接作用HCN通道，并引起通道的半数激活电位向去极化方向偏移，以增强神经元兴奋性。而毛喉素是cAMP类似物，可以刺激哺乳动物细胞内腺苷酸环化酶活化，从而促进细胞内cAMP水平升高。本文结果显示，相比sham组，其余3组在阻滞后的一段时间内MPE明显升高，EPT明显降低，说明3个干预组均成功阻断了坐骨神经的传导功能；相比Dex组，加入毛喉素的Fors 组大鼠MPE 明显缩短，MPE的缩短意味着神经反射灵敏度升高，表明毛猴素能够抑制右美托咪定对坐骨神经的阻滞作用，同时也说明cAMP介导的HCN通道是右美托咪定的镇痛靶点之一。

史艳燕等[14]研究发现，右美托咪定可以通过降低BDNF和NF-κB的表达缓解神经病理性疼痛。在中枢神经系统疼痛传导过程中，BDNF的表达量不仅仅在初级传入神经元中有所增加，在二级伤害感受神经元中也有所增加。BDNF作为疼痛的介质或调节剂，用于调节感觉神经元的生长和存活。本文单独注射布比卡因降低脊髓中cAMP、PKA、p-CREB和BDNF的表达水平，而右美托咪定联合布比卡因有助于促进cAMP/PKA-CREB-BDNF信号通路的抑制。提示该信号通路可能参与了右美托咪定延长阻滞时效的机制。

综上所述，右美托咪定联合布比卡因相比单独使用布比卡因，延长了大鼠坐骨神经感觉和运动阻滞效果和持续时间，且延长运动阻滞时效的机制与抑制cAMP/PKA-CREB-BDNF信号通路有关。