钟轩， 王红钰， 高建超， 赵金来， 张诏然

(1.唐山中心医院胃肠外科，河北省唐山市 063000；2.唐山市工人医院肿瘤外科，河北省唐山市 063000)

结肠癌是全球最常见的恶性肿瘤。手术切除是治疗结肠癌的首选方法，但仅适用于结肠癌早期和中期的根治性切除病灶或局灶性病变，但50%的新诊断患者最终发展为转移性疾病，应考虑姑息治疗[1]。化学疗法对原发性和转移性肿瘤显示出一定的作用，然而，化疗药物对正常组织和细胞具有一定的毒性[2]。因此，迫切需要找到具有低毒性、高选择性杀伤癌细胞的新型天然化合物。木犀草素是一种存在于半枝莲、金银花、菊花等传统中药中的天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、增强免疫等作用，能够抑制乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌等多种肿瘤细胞增殖，同时诱导肿瘤细胞凋亡[3-4]。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是细胞增殖、迁移和细胞外基质合成等生物学功能调节剂，也被确定为促血管生成的辅助因子[5]。本研究探讨木犀草素对人结肠癌细胞LoVo增殖和凋亡的影响及其潜在机制，为木犀草素治疗结肠癌提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

木犀草素(西安飞达生物有限公司)；西妥昔单抗(德国默克公司)；人结肠癌LoVo细胞(中国科学院上海细胞研究所)；RPMI-1640培养基和胎牛血清(上海源培生物有限公司)；四噻唑蓝(MTT)(美国Amresco公司)；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒和RIPA裂解液(北京索莱宝科技有限公司)；CTGF、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、磷酸化EGFR(phosphorylation EGFR，p-EGFR)、蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(protein serine threonine kinase，Akt)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein，Bax)、半胱氨酸天冬氨酸酶3(Caspase-3)、β-actin和辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗IgG(美国Santa Cruz公司)；二氧化碳培养箱(美国Thermo Revco公司)；Sunrise型全自动酶标仪(瑞士Tecan公司)；BD FACSCanto型流式细胞仪和BD垂直电泳仪(美国BD公司)；电泳仪和凝胶成像分析系统(北京六一仪器厂)。

1.2 细胞培养及分组

LoVo细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养，条件为37 ℃、5%CO2，取对数期细胞进行实验。将实验分为阴性对照组、阳性对照组、木犀草素低、中、高剂量组。阴性对照组细胞不进行处理；阳性对照组用40 μg/L的西妥昔单抗干预LoVo细胞，木犀草素低、中、高剂量组分别用20、40、80 μg/L木犀草素干预LoVo细胞24 h。

1.3 MTT法检测细胞增殖

将LoVo细胞以5×103个/孔接种于96孔板中(200 μL/孔)，用不同质量浓度木犀草素(0、10、20、40、80、160 μg/L)共孵育24、36、48 h后加入MTT(50 μL/孔)，继续培养4 h，离心弃上清，加入二甲基亚砜(200 μL/孔)，振荡，酶标仪在570 nm处测定光密度值(OD值)，计算细胞增殖率。根据木犀草素确定的半数抑制质量浓度及作用时间，用不同质量浓度西妥昔单抗(0、5、10、20、40、80 μg/L)共孵育LoVo细胞24 h后测定光密度值(OD值)，计算细胞增殖率。细胞增殖率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

将LoVo细胞接种于6孔板中(1×106个/孔)，按1.2方法干预细胞，24 h后收获细胞，用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，用Annexin-V结合缓冲液重悬并调整细胞为1×106个/mL，分别加入5 μL膜联蛋白(Annexin)V-FITC与5 μL碘化丙啶，充分混匀后室温避光孵育15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 Western blotting检测细胞CTGF、EGFR、p-EGFR、Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白

按1.2收获细胞后，PBS洗涤2次，加入RIPA裂解液100 μL，4 ℃裂解2 h后离心取上清，20 μg/孔进行电泳，通过SDS-PAGE分离蛋白后用半干印迹仪将其加入硝酸纤维素膜上，将膜与CTGF(1∶400)、EGFR(1∶400)、p-EGFR(1∶200)、Akt(1∶300)、Bcl-2(1∶300)、Bax(1∶500)和Caspase-3(1∶400)进行孵育，4 ℃过夜，PBS洗涤2次，将膜与辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗IgG(1∶10 000)在室温下孵育30 min，PBS洗涤2次并用ECL试剂盒显影，采集图像进行分析(以β-actin作为内参)。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 木犀草素对LoVo细胞增殖的影响

随着木犀草素质量浓度和作用时间增加，LoVo细胞增殖率降低，当木犀草素质量浓度为40 μg/L时，作用时间为24 h时，增殖率最先降到50%，故选40 μg/L作为半数抑制质量浓度，选24 h作为半数抑制时间(表1)。

表1 不同质量浓度木犀草素作用不同时间对LoVo细胞增殖的影响 单位：%

2.2 木犀草素对LoVo细胞凋亡的影响

与阴性对照组比较，其余各组细胞凋亡率均增加(P<0.05)；与阳性对照组比较，各木犀草素剂量组细胞凋亡率降低，且随着木犀草素剂量增加呈递增趋势(P<0.05；图1)。

图1 木犀草素对LoVo细胞凋亡的影响A为细胞凋亡图；B为细胞凋亡柱状图。1为阴性对照组；2为阳性对照组；3、4、5分别为木犀草素低、中、高剂量组。a为P<0.05，与阴性对照组比较；b为P<0.05，与阳性对照组比较；c为P<0.05，与木犀草素低剂量组比较；d为P<0.05，与木犀草素中剂量组比较。

2.3 木犀草素对LoVo细胞CTGF、EGFR、Akt、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的影响

与阴性对照组比较，其余各组细胞CTGF、p-EGFR/EGFR、Akt和Bcl-2蛋白水平降低，Bax和Caspase-3蛋白水平增加(P<0.05)。与阳性对照组比较，各木犀草素剂量组细胞CTGF、p-EGFR/EGFR、Akt和Bcl-2蛋白水平增加，Bax和Caspase-3蛋白水平降低，且随着木犀草素剂量增加呈剂量效应关系(P<0.05；表2和图2)。

表2 木犀草素对CTGF、EGFR、Akt、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的影响

图2 木犀草素对CTGF、EGFR、Akt、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的影响A为阴性对照组；B为阳性对照组；C为木犀草素低剂量组；D为木犀草素中剂量组；E为木犀草素高剂量组。

3 讨 论

随着人民生活水平的提高，脂肪摄入增加，而碳水化合物和富含纤维食物的摄入逐渐减少，从而导致结肠癌的发病率增加。既往研究认为，人类恶性肿瘤不仅是细胞增殖失控的疾病，而且是细胞死亡异常的疾病[6]。体内细胞增殖与凋亡之间的平衡一旦被破坏，就会发生肿瘤，而这种不平衡通常是由细胞凋亡的调节紊乱引起。肿瘤化学预防是指使用无毒化学物质抑制、延迟或逆转癌变过程[7]。木犀草素是一种天然的黄酮类化合物，在体外实验中已被证明具有抗肿瘤活性[8]。本研究结果显示，木犀草素抑制LoVo细胞增殖具有剂量和时间依赖性。流式细胞结果也显示，木犀草素能诱导LoVo细胞凋亡。西妥昔单抗是一种嵌合单克隆抗体，是一种用于转移性结直肠癌治疗的EGFR抑制剂[9]。同时，本研究发现，木犀草素对LoVo细胞具有一定生物学作用，虽然没有西妥昔单抗强，但考虑到西妥昔单抗不良反应较多。因此，还是需要进一步研究木犀草素的抗结肠癌功能的价值。

CTGF/EGFR通路与肿瘤的发生发展密切相关，参与细胞的增殖、黏附、迁移、血管生成及预后预测。CTGF是转化生长因子-β的转录靶点，可与其他生长因子、细胞外基质蛋白和细胞表面蛋白相互作用[10]。转化生长因子-β通过典型的Smad2/3通路激活CTGF表达，该通路在癌症发展中已得到充分研究[11]。在结肠癌中，CTGF的高表达与晚期临床分期和淋巴结转移有关[12]。CTGF表达沉默可显著降低体内肿瘤生长和血管生成[13]。EGFR是一种具有酪氨酸激酶活性的膜受体，在人类表皮细胞和基质细胞中广泛表达，并在多种人类恶性肿瘤中高表达，EGFR通过与CTGF结合磷酸化激活下游信号级联[14]。EGFR介导的信号转导作用是多向的，包括增殖、迁移、细胞分化和内环境的稳定，与细胞再生和恶性肿瘤的发生发展密切相关[15]。EGFR介导磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路，在细胞凋亡和细胞发育中起关键作用[16]。PI3K/Akt通路在细胞的增殖和凋亡过程中起着重要的作用，并且在肿瘤细胞中大多数PI3K/Akt信号通路都被激活[17]。研究表明，各种化学治疗药物通过阻断PI3K/Akt通路激活发挥其抗癌作用。本研究结果显示，木犀草素抑制LoVo细胞中CTGF表达，从而抑制EGFR的磷酸化，导致Akt表达降低。

在抗肿瘤治疗中，抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡是其主要的治疗策略。凋亡的一个主要调控步骤是由Bcl-2蛋白家族的抗凋亡成员和促凋亡成员的比例控制的，这决定了细胞对凋亡的易感性[18]。Bax是Bcl-2家族的促凋亡因子，在正常情况下以单体形式位于细胞质中或松散地附着在细胞膜上。在凋亡信号刺激后，胞质中的Bax易位到线粒体，导致抗凋亡蛋白如Bcl-2及其相关蛋白控制细胞色素C(Cyt C)从线粒体的释放。在细胞质中，Cyt C激活Caspase-3，最终诱导细胞凋亡[19]。本研究结果显示，木犀草素抑制LoVo细胞中Bcl-2表达，促进Bax和Caspase-3表达，从而诱导LoVo细胞凋亡。

综上所述，木犀草素通过抑制CTGF/EGFR通路而抑制LoVo细胞增殖，诱导LoVo细胞凋亡，表明木犀草素可能具有治疗和/或辅助治疗结肠癌的作用。