王祥聪， 汪忠华,2， 程利平， 吴范宏,2

（1. 上海应用技术大学 化学与环境工程学院，上海 201418；2. 上海绿色氟代制药工程技术研究中心，上海 201418）

冠状病毒不仅会在野生动物中传播，而且还可能导致人类患病[1]。在过去的二十年中，冠状病毒已有2次大规模的大流行，即严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS）和中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrome, MERS）[2-3]。有充分的科学研究表明，野生动物体内早已储存多种冠状病毒[4-8]，可能具有人畜共患的特点[9]，其中某些病毒可能引起大规模流行病的暴发[10-11]。2019年12月，湖北省武汉市发现了一种严重的呼吸系统疾病[12]。2020年2月11日，世界卫生组织宣布，将此种新型冠状病毒肺炎命名为“COVID-19”（Corona Virus Disease 2019）；而国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为“SARS-CoV-2”[13]。作为一种RNA病毒，尽管与其他冠状病毒一样，由于基因组编码的核酸外切酶使其突变率可能比其他RNA病毒低一些，但COVID-19仍具有高突变率的固有特征[14]。对完整病毒基因组的29 903个核苷酸进行系统化分析，结果表明，该病毒与1组SARS样冠状病毒最为相似，相似度高达89.1%，且全基因组水平与蝙蝠冠状病毒有96%相同[15]。用于CoV物种分类的ORF1ab中的7个保守复制酶结构域的氨基酸序列在COVID-19和SARS-CoV之间具有94.4%的同一性，表明这2种病毒同属于SARSr-CoV[16]。无论是SARS-CoV还是MERS-CoVs基因组中都包含2个开放阅读框ORF1a和ORF1b，它们被宿主核糖体翻译成2个各自的病毒多聚蛋白pp1a和pp1ab。在冠状病毒中，有1个重要的药物靶标是3C蛋白酶（3CLpro），其在处理从病毒RNA翻译而来的多聚蛋白的过程中起着重要作用[17]。3CLpro是一种半胱氨酸蛋白酶，具有高度保守的三维结构，由ORF1a编码。3CLpro负责切割多聚蛋白后11个位置，从而导致SARS-CoV和MERSCoVs中总共释放16种非结构蛋白。3CLpro的同型二聚体形式在底物存在下具有活性。3CLpro的晶体结构显示每个单体均由3个结构域组成：2个结构域与催化半胱氨酸形成胰凝乳蛋白酶样结构，并通过长环连接至第3个C末端结构域[18]。对于蛋白水解位点，在P1位置的3CLpro偏爱使用谷氨酰胺，在P2、P3和P4位置的分别使用亮氨酸、碱性残基和小的疏水残基；在P10和P20位置的使用小的疏水残基，但在P30位置的没有强烈的偏好[19]。自动裂解过程对于病毒繁殖至关重要，因此3CLpro是抗冠状病毒感染的良好药物靶标。

在这场发展迅速的新冠肺炎疫情中，各类中西药起到了重要的治疗作用。选取部分抗病毒中药、抗病毒西药以及课题组内合成的化合物，基于3CLpro为靶点进行分子对接，虚拟筛选出抗COVID-19病毒活性较高的中西药，为治疗新型冠状病毒提供可能的候选药物。

1 虚拟实验方法

1.1 3CLpro 靶点分子对接模型构建

在蛋白数据库网站RSCB（http://www.rcsb.org）下载SARS-CoV-2冠状病毒的3CLpro蛋白结构（PDB ID:6LU7），该蛋白的三维结构由上海科技大学饶子和/杨海涛课题组发布。使用Sybyl软件先除去蛋白结构中的配体、水分子，加氢和分配相关电荷等，再对蛋白进行能量优化。

1.2 小分子配体库的建立

将所有的小分子转化成MOL2格式文件，使用Sybyl软件进行能量优化，使能量最小，并建立优化后的分子表单。

1.3 小分子配体库与受体蛋白的分子对接

基于1.1构建的三维结构模型，利用SYBYL软件中的Surflex-Dock模块，根据配体分子结构定义3CLpro分子的活性口袋。通过1.2构建的分子表单利用SYBYL软件中的 Surflex-Dock （SFXC）进行分子高精度分子对接。

2 结果与讨论

2.1 配体小分子虚拟筛选结果

配体小分子虚拟筛选结果如表1所示。打分值（total score）是分子对接中最重要的一项指标，当total score＞4，小分子被认为是相应受体蛋白的特异性配体[20]，当total score＞6，小分子被认为是能与相应的受体产生相互作用[21]。共有14个小分子的total score＞6。其中Sit-144和Remdesivir的total score相对较高，分别为8.941 3和8.047 1，且Sit-144的total score（8.941 3）高于原始蛋白配体的（8.474 1）。Crash为配体进入蛋白质的不适当侵入的程度和配体原子之间的不恰当自我冲突，值越趋近于0越好；Polar为氢键和盐桥相互作用对总得分的贡献；Similarity为对接分子和配体之间相似性打分。

表1 （续）

表1 （续）

表1 （续）

表1 （续）

表1 （续）

表1 （续）

表1 小分子对接结果Tab. 1 Docking results of small molecules

2.2 分子对接分析

由于Sit-144打分值最高且高于原始蛋白配体，而Remdesivir在实际治疗中表现出了抗新型冠状病毒活性，所以以 Sit-144与 Remdesivir为例，分析配体小分子与3CLpro靶点间的相互作用（氢键及其键长、疏水作用等）。

如图1所示，Sit-144的磷酰胺键上的氨基与Gln189形成氢键，键长为0.211 nm。伯氨基和Met49和Asp187形成氢键，键长分别为0.228 nm和0.233 nm。酯上的碳氧双键与Glu166形成氢键，键长为0.218 nm。磷酸酯上无取代苯环与Leu27与Cys145形成疏水相互作用，距离分别为0.522 nm和0.428 nm。

图1 Sit-144与 SARS-CoV-2 3CLpro蛋白酶的结合模式Fig. 1 The binding mode of Sit-144 and SARS-CoV-2 3CLpro protease

如图2所示，Remdesivir三嗪环上的伯氨和Asn142形成氢键，键长为0.291 nm。四氢呋喃环上氧原子与Thr26形成氢键，键长为0.211 nm。磷酰基团上的羰基与Cys145上的巯基和伯氨基形成2个氢键，键长为分别为0.217 nm和0.256 nm。羧酸酯链上的两端的甲基分别同Met165、Met49与His41形成疏水作用，距离分别为 0.437 nm、0.342 nm和0.411 nm。

图2 Remdesivi与SARS-CoV-2 3CLpro蛋白酶的结合模式Fig. 2 The binding mode of Remdesivi and SARS-CoV-2 3CLpro protease

Sit-144和Remdesivi 同3CLpro蛋白酶形成的氢键数目均为4个，Sit-144同3CLpro蛋白酶形成的疏水作用弱于Remdesivi 同3CLpro蛋白酶之前的疏水作用，可能是Sit-144打分值高于Remdesivi的原因。

3 结 语

针对新冠肺炎这种全球大流行传染病，基于现有的抗病毒中西药以及课题组内合成的小分子（共75种结构），进行虚拟筛选，使用3C蛋白酶进行分子对接。当total score＞4，小分子被认为是相应受体蛋白的特异性配体，当total score＞6，小分子被认为是能与相应的受体产生相互作用。分子对接中共有61个小分子total score＞4，14个小分子total score＞6。其中Sit-144和还在临床试验中的Remdesivir的total score最高，分别为8.941 3和8.047 1，并且Sit-144高于Remdesivir，说明Sit-144对于SARS-CoV-2的抗病毒活性可能要高于Remdesivir。本研究为新冠肺炎相关药物的选择提供一些参考。