禽流感病毒溯源

2022-06-25王志生尤东峰孙振洲吉林省东丰县农业综合执法大队李海博东丰县梅花鹿产业发展服务公司

中国畜牧业 2022年10期

文│王志生尤东峰孙振洲（吉林省东丰县农业综合执法大队）李海博（东丰县梅花鹿产业发展服务公司）

流行性感冒病毒（influenza virus）是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表，简称流感病毒。以人、猪、马及各种家禽和野生禽类为自然宿主，海豹或水貂等其他动物也有罹患流感的情况，但这些动物作为自然宿主的结论还未特别明确。人和哺乳动物的流感一般呈急性呼吸道疾症状，但禽流感从隐性感染到急性致死性发病都有出现，症状变化范围广。A型流感病毒虽然分布于包括人在内的哺乳动物及禽类，但B型流感病毒和C型流感病毒感染只限于人。近年来，禽流感病毒已引起人们的高度重视，除了经济因素外，认为其对人的新型流感株可能有提供遗传因子的重要作用。同时具有人流感病毒表面抗原和禽类病毒内部蛋白的重组病毒是对猴子有免疫源性的弱毒，表明利用禽流感病毒遗传因子的重组来建立弱毒活苗株是可能的。

一、病毒溯源

有关禽流感病毒最早记载是1878年报告在意大利发生的鸡瘟（FP），根据鸡瘟病原体有滤过性而认为是病毒。研究证明，鸡瘟病毒具有A型流感病毒内部的蛋白抗原，并首次表明鸡瘟病毒（FPV）是流感病毒。由鸡瘟引起的鸡和火鸡感染在世界各地屡见不鲜，1924～1926年在日本发生过鸡瘟，后来明确了病原与古典的FPV相同。1949年，德国从鸡瘟病鸡体内分离出N病毒，因鸡的死亡率仅为20%，故认为是FP的弱毒变异株。1960年证明了N病毒是A型流感病毒，1952年加拿大从有神经症状的鸭雏中分离到能凝集红细胞滤过性病毒，后来确定为A型流感病毒。1983年，美国宾夕法尼亚州的鸡群发生禽流感大流行。认为这次流行的病毒可能是由野鸭传入。这对进一步理解流感病毒的病源性和生态现象具有重要意义。

在美国宾夕法尼亚州初期流行的鸡群中，从病鸡气管内分离到的流感病毒鉴定为A型H5N2亚型，这时病鸡的症状轻微，将分离的病毒接种给健康鸡只未见发病，而且病毒抗原亚型也与已知的古典FPV的H7N7或H7N1不同。但经过一段时间，病毒病原性突然增强，病势趋于严重，30%以上的鸡冠肿胀坏死，并呈神经症状，于2～3天内死亡。这些症状和经过与古典鸡瘟相同。从死鸡实质脏器、鸡舍内尘埃和苍蝇体表均可分离到H5N2病毒，这次流感也扩散到两个相邻的州。据估计，这次流行造成的损失总额达到6000万美元。这次流行到1984年2月才得到控制，至同年6月病毒及抗体检查才全部转换为阴性。在这次流行中初期毒力很弱的H5N2病毒，如何获得强的病原性问题，科研人员将1983年4月分离的病毒和10月分离的强毒株RNA通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行比较，因为两者8个片段的迁移率没有差异，认为其没有与其他病毒发生基因重组。接着研究了两种病毒HA（血凝素）的氨基酸排列发现有少许发生了转换，其中，认为在HA三维结构上，在靠近HA1和HA2断裂处的第23号氨基酸发生交换。也就是说原始株HA有糖链附着，而强毒株则由于氨基酸的交换缺乏糖链。实际上强HA糖蛋白的聚丙烯酰胺琼脂电泳迁移比较快，就是因为与弱毒株相比，缺少一个糖链的缘故。流感病毒的病原性和其HA的断裂具有密切关系。在本次流行中，弱毒株HA的邻裂部位因被糖链所覆盖，细胞内不能使其发生断裂，但强毒株的这个部位是裸露的，可以发生断裂。因此，糖链有抑制酶的作用，此种变异对病毒的毒力有很大影响，这应予以关注。

鸡、鸭、鹅、鸽子、珍珠鸡、鹌鹑等陆禽和水禽都会感染发病，但以火鸡和鸡最为易感，发病率和死亡率均较高，其中鸭和鹅等水禽可隐性感染或携带病毒，有时也会大量死亡。各日龄的鸡和火鸡均可感染，水禽幼雏死亡率较高。

二、易感种类

流感病毒不仅分布在家禽和观赏鸟中，而且也广泛分布于野禽中。1961年南非发生了大量燕鸥死亡，研究人员从其尸体中分离到流感病毒。在澳大利亚东海岸某无人岛的健康海鸥气管内分离到H6N5。在美国西海岸被击落的2000只野鸭和34只鸭的气管及泄殖腔中分别分离到41株及7组HA亚型的流感病毒。分离到病毒的野鸭达9种之多。此后，世界各地从健康野鸭泄殖腔、肠管乳剂或粪便中均分离到大量的流感病毒。从野鸭分离的这些流感病毒均涉及红细胞凝集素和神经氨酸酶的抗原亚型，几乎包含两种抗原型和所有组合型。实验感染证明，来自野鸭及虎皮鹦鹉的毒株都能在鸭肠管内增殖，经1～3周随粪便排出，毒株在4～6天达最高值，相当于10000000EID50。

将野鸭病毒给家鸭静脉接种时，同口腔或鼻腔接种一样，病毒均在肠管内增殖。鸭体内增殖部位是大肠，特别是结肠。荧光抗体法证明，结肠形成隐窝的单层圆柱上皮细胞是主要靶向细胞。粪便内的病毒在4℃下感染性能保持30天，在20℃时至少能保持7天。因此，在野鸭栖息的湖岸边和水里有大量流感病毒，从湖沼岸边的水禽粪便和水中分离到流感病毒就能证明有水源传播的可能。

科研人员将野鸭泄殖腔试纸样品在抗体存在下进行鸭体替代来分离病毒，结果在300个样品中有19例分离到2个亚型病毒，2例分离到3个亚型病毒，表明在自然界中有混合感染的可能。

不同禽类感染禽流感的概率不同，但目前尚未发现高致病禽流感的发生与禽的性别有关，不过高致病性禽流感病毒也可通过禽蛋传播。世界卫生组织（WHO）认为，病禽粪便是传播的主要渠道，候鸟迁移也是传播的主要途径。

三、毒株变异

1.抗原变异，即或HA亚型相同，其抗原性也有显著差异。早期科研人员在研究中应用H4流感病毒的HA单位克隆抗体，对从世界各地收集的25株H4流感病毒的抗原进行检查。根据反应类型可将这些病毒分成4群。其群别与宿主鸟的种类有关，与分离的年份无关。另外，DK/Czeh/56和DK/Hokkaibo/6/80虽是相隔24年分离到的病毒，但其与单克隆抗体的反应类型完全相同，说明两者的HA抗原性非常接近。结果表明，即或是同一类型，之所以得到HA抗原性不同的变异病毒，是由于它们分布在禽类之间的缘故，似乎不是来源于某种特定的病毒所引起的抗原漂移。

早期科研人员应用抗H3病毒HA的单克隆单抗体对1977年及1980年北海道从野鸭分离到的H3N2及H3N8病毒的HA抗原性进行检查，结果证明他们相互极为近缘。

2.与抗体的相互作用。用单克隆抗体证明了每个HA分子上存在3～4个非重复抗原决定簇。抗原决定簇的数量与人的H3HA相同。在任何抗HA单克隆抗体中，虽不能抑制同源病毒的红细胞凝集作用，但含有中和感染性的物质。

3.近年发生的高致病禽流感毒力较强，可引发IV型变态反应，是导致进行性肺炎、急性呼吸道窘迫综合征（ARDS）和多器官功能性障碍综合征（MODS）等并发症的根本原因。研究结果表明，高致病性禽流感病毒主要通过空气传染，借助病毒表面的血凝素（H），与呼吸道黏膜上皮细胞的核蛋白结合，在核内组成RNA型可溶性抗原，并渗出至胞质周围，复制子代病毒，通过神经氨酸作用，用出芽方式排出上皮细胞。一个复制周期为4～6小时，排出的病毒扩散至附近细胞，产生炎症反应，临床上出现发热、肌肉痛和白细胞降低等全身毒血症样反应。

四、传播途径

流感病毒可在不同禽种之间传播是很明确的。自然条件下，病毒在禽与猪之间也可能发生传播。1979年12月，美国马萨诸塞州发现了许多死亡海豹，病例到1980年1月达到顶峰，病理剖检结果显示，肺有严重实质性病变，死亡海豹数500头，死亡率约为20%。从死亡海豹的内脏中分离到了流感病毒，经鉴定，其抗原与A/FPV/Dutch/27（H7N7）为同一亚型。分离病毒的抗原体性、核酸和核酸产物上的结构蛋白都与各种禽类流感病毒极为相似。暗示鸟类流感病毒有直接感染人或其他哺乳动物的能力，并可能引起流行。

从1982年6月到1983年3月，在美国马萨诸塞州的海豹再次发生流感，分离到的病毒为H4N5抗原亚型，与以前的流行无关。研究人员认为，禽类流感病毒对海豹的传播是在自然状态下发生的，也许是人或动物的新型流感病毒株出现的前驱阶段。

2020年英国一场不同寻常的禽流感疫情导致一家野生动物康复中心的5只天鹅、3只海豹和1只狐狸死亡。在这个案例中，两种不同的哺乳动物被感染，并发展成严重的疾病。研究人员发现，在死去天鹅、海豹及狐狸的检验样本中均检测出H5N8，是禽流感毒株H5N8的一个突变，可能是病毒从鸟类传染到哺乳动物的原因。

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室在H7N9禽流感病毒适应哺乳动物宿主机制研究方面取得重要进展，相关研究成果以“Low polymerase activity attributed to PA drives the acquisition of the PB2 E627K mutation of H7N9avian influenza virus in mammals”为题于6月18日在线发表于美国微生物学会（ASM）旗下顶级刊物。

禽流感病毒需要获得哺乳动物适应性突变后才能在人体内有效复制和传播。早在1993年，美国科学家就发现，流感病毒在哺乳动物细胞中复制时会在病毒聚合酶蛋白PB2上发生E627K突变，但该突变产生的机制26年来一直是未解之谜。自2013年H7N9流感病毒在我国出现后，已造成1568人感染，死亡率接近40%。前期研究发现，PB2/E627K突变是H7N9流感病毒对人致病力增强的关键，同时该突变增加了H7N9病毒在人之间的传播能力。

五、病源性

因为病原性或毒力是由宿主和病毒的相互条件决定的，禽类流感病毒有从被感染宿主不表现症状的弱毒到引起突然死亡的强毒，毒力参差不同，因此，病原性的研究在早期几乎都用禽类流感病毒来进行。关于感染性、病原性或神经毒性的研究表明，一些基因发生重组，断裂成HA1及HA2是感染性进一步发挥毒力所必要的。科研人员在细胞培养系统中证实了决定宿主范围的是P3基因，而WSN株对小白鼠的神经毒性，NA、M和NS 3种基因都是必需的。鸡能发挥病原性的重组病毒，在鸡体温41℃时，具有良好的增殖性质，此性质是由聚合酶基因编码的。

研究过程中还曾注意过在野鸭肠道内增殖的病毒，其中一组来源于人毒株的HA，另外7株基因片段来源于野鸭株的重组体，8株中7株不能在野鸭肠道内增殖。在鸭肠道内增殖的病毒的HA抗原性发生了变异，检查这种变异病毒的HA基因碱基排列，发现氨基酸排列的第226号和第228号位置发生变异。发生变异的场所是受体结合部位。因此，在此系统中，在肠道内增殖的组织亲和特性依赖于受体结合部位，也就是说依赖于受体的特异性。现已证实，像这种变异即使在自然条件下也会发生。

六、治疗

自2013年以来，H7N9亚型流感病毒在我国连续引起5波人H7N9疫情，共造成1564人感染，其中615人死亡，引起全球高度关注。疫情期间，人们由于恐惧而拒绝食用禽肉及禽蛋，致使大量禽产品被销毁，每年给养禽业造成600～800亿人民币的经济损失。同时，H5亚型禽流感病毒持续对我国家禽养殖业构成威胁。该团队围绕我国H7N9及H5亚型禽流感防控的国家重大需求，在科学认知H7N9病毒和有效防控H7及H5亚型高致病性禽流感中取得了重大研究成果。

2021年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感基础与防控研究创新团队首席科学家陈化兰院士领衔的“重组禽流感病毒（H5＋H7）灭活疫苗的创制及应用”的研究成果获2021年度黑龙江省科学技术进步一等奖。揭示了H7N9病毒遗传演化和生物学进化规律，发现高致病性H7N9病毒对人具有更大危害，为我国H7N9流感防控政策的制定提供重要科学依据；创制出“一次免疫”可同时防控H5和H7亚型禽流感的反向遗传学灭活疫苗，居世界领先水平，获得国家一类新兽药证书，及时推向应用并适时更新疫苗种毒。相关研究结果在《CellResearch》（IF＝25.617）、《Cell Host &Microbe》（IF＝21.023）和《SCIENCE CHINA Life Sciences》（IF＝6.038）等期刊发表。截至2020年年底，创制的疫苗在家禽中累计应用超过480亿羽份，满足了我国高致病性禽流感的防控重大需求，有力保障了家禽业健康发展，新增总经济效益2229亿元人民币，并成功从家禽源头阻断了人感染H7N9病毒的可能，产生巨大的社会效益。