■冯 鑫 周金影 栾嘉明 杨东旭 杨 濛 张 敏 金英海 耿春银*

（1.延边大学农学院，吉林 延吉 133000；2.延边大学，东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心，吉林 延吉 133000）

棉籽粕是优质的蛋白质资源，但因含有游离棉酚等抗营养因子，在动物生产中的应用常被限制。游离棉酚是一种具有醛基和活性羟基的棉酚，长期食入可对动物的血管、细胞神经造成危害，使动物的生理功能发生紊乱，影响动物的生长发育[1]，因此棉籽粕的脱毒处理对其开发与应用尤为重要。

目前，关于棉籽粕脱毒方法主要有化学脱毒法、物理脱毒法、生物脱毒法等。微生物固态发酵法属生物脱毒法，是将微生物接种到特定的固态培养基中，利用微生物在生长代谢过程中会产生的生物酶，作用于游离棉酚等抗营养因子，降解游离棉酚或者将游离棉酚转化为结合棉酚，进而达到降低棉籽粕毒性的目的[2]。微生物固态发酵条件温和，相较传统的物理、化学方法对棉籽粕中营养物质的破坏程度较低，具有成本低、效果好、较安全等优势，是最具前景的棉籽粕脱毒方法之一。可用于降解游离棉酚的微生物主要有假丝酵母、黑曲霉等真菌和枯草芽孢菌和乳酸菌等细菌[3-4]。由于不同微生物菌种产酶种类及能力不同，对游离棉酚的降解效果也存在差异，因此筛选优良的微生物菌种是保证棉籽饼（粕）脱毒效果和营养价值的首要步骤，鉴于此目的，本试验选取了不同菌种对棉籽粕固态底物进行发酵，以选取出最优的发酵菌株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

棉籽粕由延边大学农学院动物营养实验室提供（见表1），使用前粉碎过40目筛。

表1 棉籽粕营养成分

乳酸菌和酵母菌1 号由延边大学农学院动物营养实验室保存；黑曲霉菌（菌种编号为CICC 41481）、红曲霉菌（菌种编号为CICC 41606）、地衣芽孢杆菌（菌种编号为CICC 21112）、枯草芽孢杆菌10071（菌种编号为CICC 10071）、枯草芽孢杆菌10089（菌种编号为CICC 10089）均购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心；拉曼酵母菌（菌种编号为CNCMI-1077），购自拉曼营养公司；福邦活性酵母菌，购自福邦酵母股份有限公司。

酵母菌和黑曲霉菌的培养基为PDA 培养基，成分为马铃薯淀粉5 g、葡萄糖20 g、氯霉素0.1 g；乳酸菌的培养基为MRS 培养基，成分为蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸二铵2 g、乙酸钠5 g、葡萄糖20 g、吐温-80 1.0 mL、硫酸镁0.5 g、硫酸锰0.25 g、琼脂15 g、纯化水1.0 L；红曲霉菌的培养基为麦芽汁培养基，成分为5°Bé麦芽汁1.0 L、琼脂15 g；枯草芽孢杆菌的培养基成分为蛋白胨10 g、牛肉粉10 g、氯化钠（NaCl）5 g、琼脂20 g、纯化水1.0 L；地衣芽孢杆菌的培养基成分为蛋白胨5 g、牛肉浸提物3 g、NaCl 5 g、琼脂15 g、纯化水1.0 L。以上培养基使用前均在121 ℃高压灭菌20 min。

1.2 试验设计

本试验采用单因素试验设计，取50 g 棉籽粕于棕色广口瓶中，加入50 mL 的水（按100%的接水量），分别接入5 mL（按10%的接种量）酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌、黑曲霉菌、红曲霉菌，具体分组见表2，每组6 个平行，pH 自然，用无菌的玻璃棒搅拌均匀，保鲜膜封盖广口瓶，并在保鲜膜上扎口。在30 ℃培养箱中静置，好氧培养72 h[5-6]。通过对发酵棉籽粕中游离棉酚含量、营养价值和酶活性指标进行分析，比较不同菌种的发酵效果，选出最优的发酵菌种。

表2 微生物固态发酵棉籽粕的分组情况

1.3 感官指标的测定

样本发酵72 h后，每组随机抽取3个进行感官评定。

1.4 游离棉酚和pH的测定

游离棉酚含量采用国标间苯三酚法进行测定[7]，pH使用实验室pH计ST3100进行测定。

1.5 活菌数的测定

活菌数使用计数板在显微镜下进行测定[13]。

1.6 营养物质含量的测定

粗蛋白含量的测定使用FOSS 8400 全自动凯氏定氮仪；干物质、粗脂肪、粗灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的含量按GB/T 6435—2014[8]、GB 6433—2006[9]、GB 6438—2007[10]、GB 20806—2006[11]、NY 1459—2007[12]的方法进行测定；半纤维素含量由NDF含量减去ADF含量计算得出。

1.7 酶活性的测定

酸性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶以及纤维素酶活性使用试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）测定；酸性木聚糖酶、中性木聚糖酶、碱性木聚糖酶活性使用试剂盒（合肥莱尔生物科技有限公司）测定；总淀粉酶含量由α-淀粉酶含量加上β-淀粉酶含量计算得出。

1.8 数据分析

试验的数据均采用SPSS 21.0 软件的GLM 模型进行方差分析，并用LSD、Duncan’s法进行多重比较，P>0.05表示差异不显著，P<0.05表差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同菌种发酵对棉籽粕感官指标的影响（见表3）

由表3可知，通过发酵后的棉籽粕颜色会较大程度地加深，其中对照组为黄褐色，伴有棉籽油的香气。T1、T2、T3组发酵棉籽粕底物呈深褐色，酒香味浓郁。T4组发酵后的颜色为深褐色，且伴有浓浓的酸味。T5、T6、T7、T8组发酵后成深棕色，腐败味儿浓厚。T9组发酵后的棉籽粕为深褐色中带有白色，且伴有醇香味。

表3 不同菌种发酵棉籽粕底物的感官指标变化

2.2 不同菌种发酵对棉籽粕游离棉酚含量、pH 及活菌数的影响（见表4）

表4 不同菌种发酵对棉籽粕游离棉酚含量、pH及活菌数的影响

由表4可知，与对照组相比，T1～T9组的游离棉酚的含量均显著降低（P<0.05），其中T1组对棉籽粕的降解效果优于其他菌种，游离棉酚降解率高达75.39%。此外，T1～T9组发酵后的pH均显著降低（P<0.05）。除T7 组外，经过固态发酵后各处理组相应的活菌数量均较发酵前有所升高。

2.3 不同菌种发酵对棉籽粕底物营养价值的影响（见表5）

表5 不同菌种发酵对棉籽粕底物营养价值的影响（%）

由表5 可知，与对照组相比，经菌种发酵后干物质、粗灰分、酸性洗涤纤维以及半纤维素含量均没有显著的变化（P>0.05），发酵棉籽粕的粗脂肪和粗蛋白含量显著提高（P<0.05），中性洗涤纤维的含量显著降低（P<0.05）。在粗蛋白方面，T1 组和T8 组的含量显著高于除T9组外的其他组（P<0.05）。

2.4 不同菌种发酵对棉籽粕底物中酶活性的影响（见表6）

表6 不同菌种发酵对棉籽粕底物中酶活性的影响（U/g）

由表6可知，与对照组相比，T1～T9组的酸性蛋白酶、中性蛋白酶和中性木聚糖酶的活性显著升高（P<0.05），其他酶活性指标没有显著性差异（P>0.05）。

3 讨论

感官指标是评价棉籽粕利用效果的最直接的指标。在发酵的前期棉籽粕的黏度较小、物料分散，在发酵的后期，棉籽粕的黏度增大且呈块状。颜色方面，通过不同的菌种固态发酵后的棉籽粕底物颜色皆为棕色或褐色，差异不大。气味方面，枯草芽孢杆菌发酵后呈现腐败气味，可能与枯草芽孢杆菌在发酵过程中发生脱羧作用或者脱氨作用产生有机氨、有机酸和氨气有关。枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉菌的腐败气味也可能与其特性有关，由于他们皆是好氧菌，在发酵后期氧气的供应量不足，导致发酵不充分，发生结块，产生腐败的味道[14]。红曲霉菌发酵产生醇香味，酵母菌1号菌、福邦酵母菌、拉曼酵母菌发酵后呈酒香味，与真菌在固态发酵过程中产生醇类物质有关[15]。乳酸菌产生浓浓的酸味则可能是发酵过程中生成的有机酸和乳酸导致的[16]。从实际生产角度出发，酒香味和醇香味的适口性更好，可考虑使用酵母菌和红曲霉菌固态发酵棉籽粕。

通过微生物发酵降解游离棉酚的关键是菌种的选择，目前报道的用于棉籽粕脱毒的菌株主要集中于酵母菌和一些天然霉菌。本试验通过不同菌种对棉籽粕进行固态发酵，各组游离棉酚的含量均显著降低，这可能是由于菌种在发酵过程中分泌氨基酸等物质，这些物质可以与游离棉酚结合，转化为结合棉酚，降低游离棉酚的含量[17-19]。通过比较发现，效果最好的是T1组，对游离棉酚的降解率高达75.39%，福邦酵母菌和拉曼酵母菌对游离棉酚同样具有很好的脱毒效果，这可能与酵母菌本身所具有的脱毒特性有关，酵母菌对真菌毒素、细菌内毒素及其他有害物质具有减毒或脱毒作用，酵母菌细胞壁中的β-葡聚糖及糖蛋白参与了生物脱毒过程[20]。通过对比可知，酵母菌1号对游离棉酚的降解作用最好，其次是拉曼酵母和福邦酵母。pH 既是发酵的条件也是发酵的影响因素，在实际生产中，其高低还是反映饲料品质的重要指标。本试验发现，不同菌种对棉籽粕发酵后pH 均显著降低，主要由于菌种在发酵过程中产生乳酸等酸性物质。

棉籽粕作为高蛋白质饲料，粗蛋白的含量是反映其营养价值的重要指标。酵母菌1 号、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、地衣芽胞杆菌、福邦酵母菌和拉曼酵母菌均可以显著提高发酵棉籽粕粗蛋白含量，其中酵母菌1 号和黑曲霉在提高粗蛋白方面优于其他菌。粗蛋白含量的增加一方面是因为菌种在发酵过程中消耗了底物中的碳水化合物等物质，降低了发酵产物的总质量，使蛋白质的比例增加[21-22]，另一方面在发酵过程中由于微生物生长而释放出大量的酶或者多肽，使底物中非蛋白物质进行转化形成菌体蛋白，进而增加了蛋白质的含量[23]。本试验中，不同菌种通过固态发酵棉籽粕后会使棉籽中的粗脂肪含量显著提高，Sun 等[24]研究中发现，固态发酵棉籽粕后，粗脂肪含量显著下降，与本试验结果不同，这可能与发酵所使用的微生物是否利用脂肪来支持菌体的生长有关[25]，有待进一步探究。此外，本试验中，发酵后的棉籽粕中性洗涤纤维含量显著降低，可能与微生物分泌的酶对纤维结构造成破坏有关，这也是发酵后纤维物质含量降低的重要原因之一[26]。

蛋白酶是指可以水解蛋白质肽键的酶，能提高蛋白质的利用率。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，具有提高纤维素利用率的作用。木聚糖酶是半纤维素酶的一种，其含量的高低是反映半纤维素利用率的主要指标。淀粉酶则是水解淀粉和糖原的酶类总称。本试验通过对不同菌种发酵后的棉籽粕进行酶活性测定发现，酵母菌、红曲霉菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌和地衣芽孢杆菌均具有提高酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及中性木聚糖酶活性的作用，而对碱性木聚糖酶、酸性木聚糖酶、半纤维素酶和淀粉酶的活性没有显著影响。

4 结论

综上，本试验所选用的9株菌种通过固体发酵均可使棉籽粕游离棉酚的含量降低，改善棉籽粕粗蛋白、粗纤维和中性洗涤纤维的含量，提高酸性蛋白酶、中性蛋白酶和中性木聚糖酶的活性。通过对发酵后棉籽粕气味、营养价值和酶活性等综合指标进行对比，3个酵母处理组的效果最好，酵母菌1号使棉籽粕中游离棉酚的含量降低75.39%，作用效果最显著。因此，可以考虑选用酵母菌对棉籽粕进行固体发酵，以达到脱毒和改善营养价值的效果。未来，也可在此基础上进一步使用混合菌种或混合底物进行固态发酵，以最大程度地发挥微生物的脱毒作用。