■张 丽 李 川 陈薪芋 邱清华 许兰娇 熊小文 温庆琪 欧阳克蕙

（江西省动物营养重点实验室，江西农业大学动物科学技术学院，江西农业大学动物营养与饲料安全创新团队，江西 南昌 330045）

传统的反刍动物营养学认为，瘤胃微生物可合成宿主所需的各种氨基酸，不需要从日粮中额外补充[1]。现代反刍动物生产中，随着动物生产性能的提高以及饲料结构的改变，对日粮外源氨基酸的需求也越来越受到关注。一方面，氨基酸的添加满足了瘤胃微生物的需要，为高产奶牛和快速生长的肉牛、肉羊提供优质而足量的微生物蛋白（MCP）来源。有学者指出，十二指肠的营养来源在很大程度上取决于瘤胃微生物发酵提供的养分数量和比例[2]。Schwab等[3]和Atasog⁃lu 等[4]认为，瘤胃微生物存在限制性氨基酸和必需氨基酸，缺乏某些氨基酸时会影响瘤胃微生物的生长繁殖[5]，降低微生物蛋白的供给。Kong等[6]发现，赖氨酸缺失改变了微生物氨基酸代谢功能，影响微生物蛋白氨基酸的组成。Abdelmegeid 等[7]发现，蛋氨酸（Met）可刺激瘤胃微生物的生长，提高纤维的消化率，增强细菌氮与微生物脂肪酸的合成。另一方面，一些氨基酸尽管在动物机体内需要量较低，但在机体的生长发育、新陈代谢与结构功能方面起着特殊功效，被称为功能性氨基酸[8]。精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）是反刍动物两种重要的功能性氨基酸，其在反刍动物生产中发挥着重要作用[9]。Arg 可通过尿素循环促进多胺生成，参与DNA和蛋白质的合成，促进妊娠时期胚胎发育，并起到免疫调节的作用[10]，提高幼龄反刍动物生长性能[11]和奶牛泌乳性能[12]。Glu及其衍生物N-氨甲酰谷氨酸（NCG）有促进奶牛生产性能、瘤胃发酵及消化代谢，缓解热应激对奶牛带来的不利影响[13-14]。目前，反刍动物氨基酸营养多集中在过瘤胃氨基酸对幼龄动物和奶牛生产上的研究，氨基酸对肉牛瘤胃发酵特别是饲粮结构改变下肥育肉牛中的研究较少。因此，本研究旨在通过体外试验，探究在肥育肉牛高精料日粮条件下添加Arg、Glu 对瘤胃发酵特性的影响，为反刍动物生产中氨基酸的营养研究提供数据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验材料

3 头安装永久瘤胃瘘管的杂交公牛[西门塔尔（♂）×锦江黄牛（♀），350 kg左右]，单栏饲喂，每日8:00和18:00 饲喂，自由采食和饮水；L-精氨酸（纯度≥98%，上海麦克林生化有限公司）；L-谷氨酸（纯度≥99.5%，上海麦克林生化有限公司）；发酵底物为瘘管牛日常饲粮，其组成及营养水平见表1。

表1 发酵底物的组成及营养水平（干物质基础）

1.2 试验设计

试验采用体外法，试验分为3 组，分别为HC 组（高精料混合料，精粗比8：2）、HCA 组（高精料混合料+0.1%L-精氨酸）、HCG组（高精料混合料+0.1%L-谷氨酸），每组4个重复，培养3、6、12 h和24 h后终止发酵。

1.3 试验方法

于晨饲前1 h 采集3 头瘘管牛瘤胃液，保温瓶中混合保存并迅速转运至实验室，使用4 层纱布对瘤胃液进行过滤。参考Menke 等[15]的方法配制人工唾液：准确量取0.175 mL A 液（13.2 g CaCl2·2H2O、10 g MnCl2·4H2O、1 g CoCl2·6H2O、8 g FeCl3·6H2O，定容至100 mL）、350 mL B 液（39 g NaHCO3，定容至1 000 mL）、350 mL C液（5.7 g Na2HPO4、6.2 g KH2PO4、0.6 g MgSO4·7H2O，定容至1 000 mL）、1.75 mL D 液（0.1%刃天青）、70 mL E 液（4 mL 1 mol/L NaOH、625 mg Na2S·9H2O，定容至100 mL）、700 mL纯化水，充入CO2至溶液从淡蓝色转为无色，按瘤胃液：人工唾液=1：2配制混合发酵液，39 ℃下保存备用。配制发酵底物，其中HCA 组中添加了0.1%（W/W）的精氨酸，HCG 组中添加了0.1%（W/W）的谷氨酸。分别称取底物0.4 g 装入100 mL 的玻璃发酵瓶中，然后向每个发酵瓶加入40 mL混合发酵液，发酵瓶注满CO2，橡胶塞密封。放入恒温摇床模拟瘤胃发酵。分别在培养3、6、12 h和24 h后冰浴终止发酵，测定产气量，过滤后测定发酵液pH，收集发酵液于-20 ℃保存，测定氨态氮（NH3-N）、MCP及挥发性脂肪酸（VFA）浓度。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 饲料营养成分测定

参照张丽英[16]的《饲料分析及饲料质量检测技术》，粗蛋白含量采用凯式定氮法测定，酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量采用滤袋法测定，粗灰分含量采用灼烧法测定，钙（Ca）含量采用高锰酸钾滴定法测定，磷（P）含量采用钼黄比色法测定。

1.4.2 发酵液pH测定

采用pHS-3S型高精度酸度计测定发酵液的pH。

1.4.3 发酵产气量测定

每隔3 h接通一次玻璃注射器，通过刻度观察产气量，记录完后排气。获取3、6、12 h和24 h的总产气量。

1.4.4 发酵液NH3-N浓度测定

取瘤胃液4 mL 涡旋振荡1 min，在1 450×g 下离心10 min，取上清液后参考冯宗慈等[17]方法测定。

1.4.5 发酵液MCP浓度测定

取3 mL 发酵液，解冻，在450×g 下离心5 min 后取上清液1.5 mL，随后在4 ℃离心机中以20 000×g离心30 min，弃上清，在底物中加入1.5 mL 氢氧化钠（0.5 mol/L），100 ℃水浴15 min，然后在4 ℃环温中以20 000×g离心30 min。采用考马斯亮蓝法[18]测定。

1.4.6 发酵液VFA浓度测定

使用安捷伦7890气相色谱仪，色谱柱DB-WAX，毛细管柱(长25 m，内径0.32 mm，膜厚0.20 μm)，氮气作为载气，流量1.2 mL/min，程序升温120 ℃保持1 min，以5 ℃/min 的速率升至200 ℃；检测器FID 温度300 ℃，氢气流量40 mL/min，空气流量400 mL/min，尾吹流量30 mL/min，以2-丁烯酸为内标物。参照秦为琳[19]的内标法测定VFA浓度。

1.5 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 24.0统计分析软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），并使用Duncan’s法进行多重比较检验，以P<0.05为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 添加Arg、Glu对体外瘤胃发酵pH的影响（见表2）

表2 高精料混合料下添加Arg、Glu对体外瘤胃发酵pH、NH3-N、MCP及产气量的影响

由表2 可知，在高精料混合料下，随发酵时间的延长，pH逐渐降低。相较于HC组，HCA组和HCG组在各个时间点均能升高pH，在发酵前期（3～6 h），HCA组和HCG组的pH显著升高（P<0.05）。而HCA组和HCG组相比，pH值均差异不显著（P>0.05）。

2.2 添加Arg、Glu对体外瘤胃发酵产气量的影响（见表2）

由表2 可知，随发酵时间的延长，产气量逐渐增加，在发酵前期（3～6 h），与HC组相比，HCA组产气量显著降低（P<0.05），HCG 组产气量显著升高（P<0.05），HCA 组和HCG 组相比，HCG 组产气量显著高于HCA组（P<0.05）。在发酵后期（12～24 h），3组之间的产气量均差异不显著（P>0.05）。

2.3 添加Arg、Glu 对体外瘤胃发酵NH3-N 浓度的影响（见表2）

由表2可知，在发酵后期（12～24 h），12 h HCA组的NH3-N浓度显著高于HC组（P<0.05），在24 h时，NH3-N浓度有升高但不显著（P>0.05）。而HCG组相较于HC组，差异不显著（P>0.05）。HCA组与HCG组相比，在发酵12 h时，HCA组的氨态氮浓度显著高于HCG组（P<0.05）。其他时间段3组间差异不显著（P>0.05）。

2.4 添加Arg、Glu 对体外瘤胃发酵MCP 浓度的影响（见表2）

由表2 可知，随发酵时间的延长，MCP 浓度呈逐渐增加趋势。与HC组相比，在发酵3、24 h时，HCA组和HCG组MCP浓度有所提高但差异不显著（P>0.05）。在发酵6 h时，HCG组的MCP浓度显著高于HC组（P<0.05），12 h 时，HCA 组和HCG 组的MCP 浓度均显著高于HC 组（P<0.05），HCA 组与HCG 组相比，MCP 浓度差异不显著（P>0.05）。

2.5 添加Arg、Glu 对体外瘤胃发酵VFA 浓度的影响（见表3）

表3 高精料混合料下添加Arg、Glu对体外瘤胃发酵VFA的影响

由表3 可知，随发酵时间的延长，3 组的TVFA 浓度逐渐增加。HCA组与HCG组相比，在各个时间点，乙酸、丙酸、异丁酸、异戊酸、TVFA浓度及乙丙比均无差异。在发酵3 h时，与HC组相比，HCA组和HCG组的乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸均显著降低（P<0.05），而丙酸、TVFA 浓度及乙丙比均表现为差异不显著（P>0.05）。在发酵6 h 时，与HC 组相比，HCA 组的丁酸浓度显著降低（P<0.05），HCG组的戊酸显著升高（P<0.05），HCA组和HCG组的乙酸、丙酸、异丁酸、异戊酸、TVFA 浓度及乙丙比均表现为差异不显著（P>0.05），HCG 组丁酸和戊酸浓度显著高于HCA 组（P<0.05）。在发酵12 h 时，与HC 组相比，HCA 组和HCG 组的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、TVFA 浓度及乙丙比均表现为差异不显著（P>0.05）。而在发酵24 h 时，与HC 组相比，HCA 组和HCG 组的乙酸和乙丙比均显著降低（P<0.05），丙酸、丁酸及异丁酸均显著升高（P<0.05），异戊酸、戊酸和TVFA浓度均表现为差异不显著（P>0.05）。

3 讨论

Arg和Glu作为功能性氨基酸在反刍动物生产上的研究已有报道。Silva等[20]研究表明，在含有赖氨酸和蛋氨酸的代乳粉中补充1%氨基谷氨酸对犊牛采食量和生产性能影响不明显。而Sato 等[21]在0.5 g 底物中添加5 mg 及以上味精发酵母液，能对体外瘤胃发酵有促进作用。Teixeira 等[22]发现在公牛饲粮上添加约0.08%的精氨酸对生产性能影响不大，但能提高肉品质。针对以上研究发现，本试验遵循低蛋白日粮原则，选择在日粮中添加0.1%的Arg 和0.1% Glu，结果发现其对体外瘤胃发酵有一定促进作用。

3.1 Arg和Glu对体外瘤胃发酵pH的影响

瘤胃pH对维持瘤胃微生物群落结构稳定、保证瘤胃微生物生命活动的正常进行起重要作用。瘤胃液的pH主要受日粮性质、唾液量、氨氮含量、VFA的生成和利用等因素的综合影响[23]。宋良荣等[24]认为添加不同氨基酸组成的三肽能有效降低瘤胃液pH，其原因是促进了瘤胃碳水化合物的发酵，增加了酸的产量。Bahram[25]、刘玉洁等[26]及宋钰等[27]发现添加Arg、Glu或谷氨酸渣均能提高瘤胃液的pH，但均未阐明其作用机制。在本试验中，在高精料中分别添加Arg或Glu对发酵3、6、12 h 和24 h 时的pH 均有所升高，结果与Bah⁃ram[25]、刘玉洁等[26]及宋钰等[27]研究一致，而与宋良荣等[24]的结果不一致。其原因可能是发酵底物不同所致。当反刍动物饲喂高精料日粮时，瘤胃pH会降低[28]。Marquis等[29]和Higuchi等[30]报道在培养基中添加Arg或Glu，各种链球菌、铜绿假单胞菌和乳酸杆菌通过精氨酸脱氨酶（ADI）系统和谷氨酸脱羧酶（GAD）系统分别代谢生成碱性物质NH3和γ-氨基丁酸（GABA），最终提高了培养液的pH。本试验中添加Arg或Glu可以提高发酵液pH的作用机制可能与上述研究一致。

3.2 Arg和Glu对体外瘤胃发酵产气量的影响

产气量是评价日粮体外瘤胃发酵程度的重要指标，在一定程度上反映了微生物的生长速率及底物的可利用性[31]。Menke 等[32]利用体外发酵法评价得出产气量与体内有机物质的消化率具有非常显著的正相关性。Bahram等[25]的研究结果表明在精粗比为55：45的条件下添加1 mmol/L Arg能显著增加12、24 h后的发酵产气量。并且Sato等[21]也发现味精副产物对瘤胃体外发酵产气量有正相关性。而姜宁等[33]发现在日粮中添加不同包被方式的蛋氨酸和赖氨酸对24 h 时体外发酵产气量没有显著影响，其产气量还略有所降低。本试验中，在发酵3、6 h时，HCG组的产气量高于高精料组，而在发酵12、24 h 时的产气量没有显著影响，与Bahram[25]结果相一致。说明发酵前期（3～6 h），添加Glu 有促进发酵、提高产气量的效果；但在发酵后期（12～24 h），由于底物消耗较大，添加Glu 对产气量没有影响。本试验中，HCA 组的产气量低于对照组，在发酵前期（3～6 h）达到显著水平，这一结果与姜宁等[33]结果相一致。以上结果说明不同氨基酸（AA）对瘤胃发酵产气量影响不同。

3.3 Arg和Glu对体外瘤胃发酵NH3-N浓度的影响

氨态氮是反刍动物瘤胃微生物将饲料中含氮物质发酵生成的主要物质，也是合成瘤胃微生物蛋白的主要来源[34]。瘤胃液中氨态氮浓度反映了饲料中含氮物质降解和微生物合成利用之间的平衡状态。Colmenero 等[35]认为日粮中蛋白质水平的提高有利于提高瘤胃液中NH3-N 水平。而李晴等[36]研究认为补充支链氨基酸有助于瘤胃微生物脱氨生成NH3-N。本试验结果发现发酵后期（12～24 h），高精料中添加Arg和Glu都能提高发酵液NH3-N浓度，且Arg组高于对照组。这与Bahram等[25]的研究结果一致。而本次试验中3、12 h和24 h在高精料中添加Glu对氨态氮含量有所提高，但差异不显著，这与Sato等[21]针对味精副产物的研究结果一致。高精料添加Arg 和Glu 发酵6 h后，NH3-N浓度有所下降，但差异不显著。与宋钰等[27]在日粮中添加谷氨酸渣饲喂肉牛及Padunglerk等[37]使用富含谷氨酸的味精副产品替代20%豆粕饲喂奶牛能降低瘤胃NH3-N浓度的结果相一致，这可能是因为在6 h时添加Arg或Glu帮助了提高瘤胃发酵及NH3-N的快速利用，提高了MCP的合成。

3.4 Arg和Glu对体外瘤胃发酵MCP浓度的影响

高精料日粮下，非结构性碳水化合物发酵菌增多，其生长更多依赖于氨基酸[38]。Guliye等[39]研究表明在缺失酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、蛋氨酸（Met）时会导致瘤胃发酵率下降，并且支链氨基酸（BCAA）可能是影响瘤胃微生物蛋白合成量的最大因素。张斌等[40]在酿酒发酵过程中发现，发酵前后Arg 和Glu 含量分别降低96.37%和87.69%，表明微生物生长对Arg 和Glu 的需求量大，同时还发现补充Glu 有助于微生物发酵。Schwab 等[3]研究表明，在缺乏Glu时，瘤胃微生物的生长速率降低；而在肉牛日粮中添加谷氨酸渣可显著提高MCP 含量。本试验中，在高精料组中添加Arg 或Glu 均能有效提高MCP 含量，这表明在高精料日粮中添加Arg 或Glu 有利于提高瘤胃发酵速率和MCP 合成，这与以上的研究结果一致。但Bahram等[25]的研究表明，在底物精粗比为55：45 的瘤胃发酵液中添加Arg，培养12、24 h时，MCP含量显著降低，其原因尚未被解释清楚。

3.5 Arg和Glu对体外瘤胃发酵VFA浓度的影响

VFA 是反刍动物主要的能量来源，其中乙酸、丙酸、丁酸约占瘤胃发酵挥发性脂肪酸的95%左右[41]。徐爱秋等[42]研究证明不同氨基酸模式对瘤胃微生物生长及发酵效率有影响。Abbasi等[43]利用瘤胃模拟技术和体外消化技术，发现在低蛋白日粮中添加高剂量过瘤胃蛋氨酸能提高瘤胃pH，并增加真胃和回肠中的TVFA及丙酸含量。而Zhang等[44]研究发现添加3种支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）发酵72 h能显著降低瘤胃体外发酵过程中乙酸和丙酸比值，并且显著提高TVFA 浓度。而在本次试验中，高精料日粮中添加Arg或Glu能显著降低24 h时的乙丙比，这与Zhang等[44]、常乐[45]的研究结果一致；但对TVFA 总量无明显影响，与Sato 等[21]在浓缩料中添加味精副产物对体外发酵48 h后的TVFA含量无显著影响的结果相一致。并且本次试验结果发现在24 h时显著提高丙酸、丁酸、异丁酸含量，这表明在高精料中添加Arg或Glu促进了瘤胃微生物对非结构性碳水化合物的发酵利用。

4 结论

在高精料混合料中添加Arg或Glu有助于提高瘤胃液pH，增加发酵后期瘤胃液NH3-N浓度，促进瘤胃微生物生长和MCP的生成，并且能改变VFA组成，但对TVFA浓度无影响。