王海波，占今舜，谷志勇,3，刘宇航，霍俊宏 ，赵生国

（1.江西省农业科学院畜牧兽医研究所，江西 南昌 330200；2.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；3.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384）

0 引言

【研究意义】反刍动物精巧的胃肠发酵系统（瘤胃或瘤-网胃）能够维持胃肠功能，并发酵、转化植物性饲料，产生挥发性脂肪酸（VFA）、甲烷气体等[1-2]。研究芦丁对湖羊瘤胃细菌菌群多样性及组成的调控，对促进反刍动物对植物性饲料的利用具有重要意义。【前人研究进展】体外发酵试验表明，沙棘黄酮可以提高微生物对氮代谢、糖代谢的能力，降低产甲烷菌、瘤胃球菌、原虫的数量[3]。而且，黄酮类化合物能增强抗氧化能力，改善动物生长性能[4-6]，并能通过影响DNA 和RNA 的合成抑制微生物繁殖，降低瘤胃微生物的数量[7-8]；还可直接作用瘤胃产甲烷菌，抑制CH4产生，提高能量利用率[9]。芦丁（芸香苷、维生素P）作为一种广泛存在于植物根、茎、叶、花、果实和种子中的黄酮类提取物，不仅可当作治疗药物，还能作为保健品，在呼吸系统、内分泌系统、胃肠系统、免疫保护等方面发挥功能[6]，具有改善动物生产性能、提高瘤胃代谢和消化能力的作用[10]。芦丁经胃肠道转运或微生物降解生成槲皮素等代谢产物，发挥抗氧化、抗菌、抗病毒和保护肾、肝脏及胃肠道黏，促进免疫器官发育，增强机体免疫力[11-12]的功能。研究发现，芦丁能够抑制对绿脓杆菌、变形杆菌等的生长[6]，并通过瘤胃代谢影响微生物的定植[13]。【本研究切入点】本课题组成员占今舜等[14]在日粮中添加芦丁对湖羊生长性能、血清生化指标、激素水平及瘤胃发酵的研究中发现，芦丁能够改善湖羊生长性能，调控纤维素、蛋白质降解效率，影响瘤胃发酵。然而有关日粮中添加芦丁对湖羊瘤胃细菌菌群多样性及其组成的影响有待深入探讨。【拟解决的关键问题】通过高通量测序探究在日粮添加芦丁对湖羊瘤胃细菌菌群多样性及组成的影响，为后续研究芦丁在湖羊中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试芦丁购自宁波玉健医药有限公司（浙江，宁波），提取自槐米（Sophora japonicaL.），纯度≥95%。

1.2 试验设计

选择3 月龄左右、健康且体重相近的湖羊36 只，随机分为3 个处理，每个处理12 只湖羊（公母各半，分栏饲养）。对照组（CON 组）饲喂基础日粮，试验组R50 和R100 分别在基础日粮中按照湖羊体重分别添加50 和100 mg·kg-1的芦丁，试验期为70 d（预试期14 d，正试期56 d）。

1.3 试验动物及管理

试验于2019 年8～10 月在江西省赣州市绿林湾农牧有限公司湖羊养殖场进行。饲养管理按照养殖场的规定执行，每天饲喂2 次，分别在8：30 和17：30 进行饲喂，羊只自由采食，饮水，隔天早上称取余料。

1.4 基础日粮

参考我国《肉羊饲养标准》（NY/T 816—2004）配制基础日粮。其中精料组成及营养水平在前期占今舜等[14]的研究中进行了详细的描述（消化能为13.39 MJ·kg-1、粗蛋白为20.06%、中性洗涤纤维为23.24%、酸性洗涤纤维为13.78%、钙为0.66%、磷为0.45%）。日粮中精料和粗料按照质量比6∶4 先后分开饲喂。粗料为铡碎的紫象草（干物质中含10.98%的粗蛋白质、2.90%的粗脂肪、14.07%的粗灰分、61.23%的中性洗涤纤维为和34.67%的酸性洗涤纤维）。

1.5 样品采集与指标测定

1.5.1 瘤胃液采集 试验结束后，选择各处理组中平均体重接近[对照组、R50 和R100 的平均体重分别 为（29.63±0.63）kg、（30.80±0.84）kg 和（29.93±0.89）kg]的湖羊（公羊）4 只快速屠宰取出瘤胃，并将瘤胃内容物经4 层纱布过滤，分装于5 mL 冻存管放入液氮速冻后-80 ℃保存，用于细菌总DNA 提取。

1.5.2 瘤胃液微生物 DNA 的提取、测序以及分析湖羊瘤胃液中总DNA 提取送至苏州金唯智生物科技有限公司，参照试剂盒说明进行细菌总DNA 提取，并使用Qubit®dsDNA HS Assay Kit 检测DNA 浓度。以20～30 ng 的DNA 为模板，使用设计PCR 引物（F：CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT，R：GG ACTACNVGGGTWTCTAATCC）扩增原核生物16S rRNA 基因V3～V4 的2 个高度可变区。PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，按Illumina MiSeq（Illumina,San Diego,CA,USA）仪器使用说明书进行双端测序，对测序结果原始图像数据利用软件Bcl2fastq（v2.17.1.14）进行图像碱基识别，质量分析，得到原始测序数据。原始数据通过Qiime 1.9.1软件进行拼接，使用Cutadapt 1.9.1 和Vsearch 1.9.6软件去除低质量序列和嵌合体进行优化得到有效数据。使用Vsearch 1.9.6 在相似性97%的水平上进行聚类成为OTUs（Operational taxonomic units），以Silva_132 16S rRNA database（http://www.arb-silva.de/）为参考，利用RDP classifier 2.2（Ribosomal Database Program）贝叶斯算法对OTU 的代表性序列进行物种分类学分析。通过软件 Qiime 1.9.1 对检测样品a多样性指数进行评估。经Qiime 1.9.1 和R 语言作图，基于Brary-Curtis 距离矩阵，进行PCoA 作图分析；基于beta 多样性距离矩阵，用R 语言进行NMDS 作图，并采用UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean）聚类方法进行样本聚类。

1.6 数据统计分析

数据经Excel 2013 初步整理后，采用SPSS 26.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA），用Duncan氏法进行多重比较，试验结果均以平均值±标准差（M±SD）表示，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 OTU 分析和物种注释

本试验中12 个样品平均每个样品测得 103 929条原始PE reads，经过质量优化平均获得90 653 条有效序列，其平均长度为453 bp，有效序列获取率为87.39%。以97%的一致性对瘤胃微生物进行OTUs 聚类绘制Venn 图（图1）可知，共得到446 个OTU。其中，3 个处理组共享396 个OTU，占总OTU 数的88.79%。同时，CON 组和R50 组共享416 个OTU，CON组和R100组共享404个OTU，R50 组 和R100 组共享402 个OTU。且CON 和R50 组分别特有15 个、1 个OTU。其中，CON 组主要以拟杆菌门的3 个菌属，分别为uncultured_rumen_bacterium（OTU83、OTU48、OTU213、OTU396、OTU397 和OTU417）、普雷沃菌属_1（OTU438、OTU84、OTU422和OTU425）及理研菌科_RC9_gut_group（OTU51）为主。通过以Silva 132 为参考数据库，利用 RDP classifier 贝叶斯算法对OTU 的代表性序列进行物种分类学注释，所有样品共注释了14 个门（Phylum）、18 个纲（Class）、21 个目（Order）、34 个科（Family）和99 个属（Genus）。通过对序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU 的数目构建稀释曲线（图2）可知，随着测序深度的增加，OTU 的数量先增加最后趋向平坦，持续抽样新物种出现的速率降低，检测到的OTU 数目不再增加，测序数据量较为合理。

图1 OTUs 分布维恩图Fig. 1 Venn diagrams of OTU distribution

图2 OTUs 的稀释曲线Fig. 2 Rarefaction curves of OTUs

2.2 Alpha 多样性分析

日粮中添加芦丁对瘤胃液微生物Alpha 多样性的影响见表1。由表可知1，日粮中添加芦丁显著影响瘤胃液微生物Alpha 多样性。相比较CON 组和R50 组，R100 组ACE 指数、Shannon 指数显著降低（P＜0.05）。R100 组Chao1 指数与CON 组相比显著降低（P＜0.05），与R50 组无显著差异。同时，CON组和R50 组Alpha 多样性均无显著差异（P＞0.05）。

表1 瘤胃液细菌群Alpha 多样性分析Table 1 Alpha diversity analysis on microbial community in rumen fluid

2.3 Beta 多样性分析

基于Brary-Curtis 距离矩阵的PCoA 作图分析（图3）可知，PC1 和PC2 对样本差异的贡献率分别为21.48%和20.00%，且样本点的距离越近，相似度越高。NMDS 分析可知，不同样本间的差异程度通过点间的距离体现，由图4 可知，Stress＜0.097，表明NMDS 可以准确反映样本间的差异程度。由PCoA分析（图3）、NMDS 分析（图4）和UPGMA 聚类方法（图5）可知，R100 组与CON 和R50 组在微生物群落结构上存在差异，而CON 和R50 组群落组成相似。Anosim 分析结果见图6。图6 中a（R=0.156，P=0.223）、b（R=0.417，P=0.064）和c（R=0.469，P=0.035）中的R值逐渐增大，表明日粮中添加芦丁能够影响微生物结构分布，且R50 与R100 两组之间存在显著差异（P＜0.05），CON 组和R50 组之间、CON和R100 组之间无显著差异。

图3 主坐标分析Fig. 3 Principal coordinate analysis

图4 非度量多维标定法Fig. 4 Non-metric multi-dimensional scaling

图5 湖羊瘤胃微生物UPGMA 聚类方法Fig. 5 UPGMA on microbes in rumen of Hu sheep

图6 湖羊瘤胃微生物群落结构Anosim 分析Fig. 6 Anosim analysis on microbial community structure in rumen of Hu sheep

2.4 湖羊瘤胃液中微生物群落组成

日粮中添加芦丁对湖羊瘤胃液中微生物在门和属水平的分布见表2～3。在门水平，由表2 可知：拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）两大优势菌门的相对丰度超过88.31%，在CON 组分别占52.84%和35.47%，在R50 组分别占59.18%和31.56%，在R100 组分别占62.76%和29.67%。日粮中添加芦丁在门水平显著影响迷踪菌门（Elusimicrobia）和髌骨细菌门（Patescibacteria）的相对丰度（P＜0.05）。相比CON 组，R100 组显著提高Patescibacteria的相对丰度，降低Elusimicrobia 的相对丰度（P＜0.05），同时R50 组Elusimicrobia 的相对丰度显著高于CON 组和R100 组（P＜0.05），其他各处理组之间在门水平均无显著差异（P＞0.05）。在属水平上，由表3 可知，CON 组、R50 组和R100 组优势菌属均为普雷沃菌属_1（Prevotella_1）和理研菌科_RC9_gut_group（Rikenellaceae_RC9_gut_group），在CON 组分别占20.28%和12.16%，在R50 组分别占26.34%和11.05%，在R100 组分别占26.79%和18.60%。在已鉴定丰度排名前30 的菌属中，日粮中添加芦丁能显著影响新月形单胞菌属_1（Selenomonas_1）、琥珀酸菌属（Succiniclasticum）、f__Bacteroidales_RF16_group_Unclassified和f__Lachnospiraceae_Unclassified的相对丰度。其中，与CON组相比，R100 组中Selenomonas_1、f__Bacteroidales_RF16 _group_Unclassified、Succiniclasticum的相对丰度显著降低（P＜0.05），但与R50 组差异不显著（P＞0.05）。同时，R100 组中f__Lachnospiraceae_Unclassified极显著低于R50 组（P＜0.01）。其他各处理组之间在属水平均无显著差异（P＞0.05）。

表2 芦丁对湖羊瘤胃微生物相对丰度的影响（门水平）Table 2 Effect of rutin on microbial relative abundance in rumen of Hu sheep (at phylum level)（单位：%）

表3 芦丁对湖羊瘤胃微生物相对丰度的影响（属水平）Table 3 Effect of rutin on microbial relative abundance in rumen of Hu sheep (at genus level) （单位：%）

3 讨论

瘤胃微生物主要由真菌、细菌和原虫组成，通过高通量测序技术可以快速高效地了解群落的种类和结构[15]，可通过α 和β 多样性对微生物群落的多样性进行评估[16]。本试验研究发现，对照组的OTU 数目大于添加芦丁的试验组，添加芦丁导致微生物多样性降低。这可能是因为芦丁作为黄酮类化合物，可引起DNA 和RNA 的合成，抑制微生物繁殖，降低瘤胃微生物的数量，并能改善瘤胃消化代谢及碳水化合物的发酵影响微生物群落的多样性[7,8,13,15,17]。本试验研究发现饲料中添加50 mg·kg-1的芦丁对瘤胃菌群的丰度及多样性均无显著性影响，但添加100 mg·kg-1的芦丁显著降低α 多样性的ACE 指数、Chao1 指数、Shannon 指数。通过PCoA、NMDS 和UPGMA 聚类方法对β 多样性分析可知，添加100 mg·kg-1的芦丁对瘤胃微生物群落有显著的影响。日粮中添加50、100 mg·kg-1芦丁不能改变瘤胃优势菌群，这与前期研究发现瘤胃优势菌群相一致[18-19]。其中，对照组、50 mg·kg-1芦丁组和100 mg·kg-1芦丁组中Bacteroidetes 和Firmicutes 占比与牦牛[20]、水牛[21]、蒙古羊[22]、湖羊[23]等反刍动物瘤胃优势菌为Bacteroidetes 和Firmicutes 的结果相似。拟杆菌门是一类革兰氏阴性菌，在核酸、脂质、蛋白质等有机物的转换和非纤维类碳水化合物的降解中发挥重要功能[15,24-25]。厚壁菌门中含有大量纤维素分解菌属，主要促进纤维的分解[15]。本研究发现，日粮中添加50、100 mg·kg-1芦丁能使瘤胃中的Firmicutes与Bacteroidetes 的比值较对照组分别降低20.56%和37.23%。变形菌门在肠道富集，容易引起炎症或外源性病原体的入侵，造成微生物群落失衡[18,26]。同时，芦丁对绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌等的生长具有抑制作用[6]。日粮中添加50 和100 mg·kg-1芦丁能使变形菌门的相对丰度较对照组分别降低71.55%，81.38%，有利于维持菌群的平衡，增强机体抵抗外源性病原体的入侵[18]。本试验研究发现添加100 mg·kg-1的芦丁显著提高Patescibacteria 丰度，降低Elusimicrobia 的相对丰度。但Elusimicrobia在胃肠中占比较低，其功能作用研究也鲜有报道，需进一步探讨。

日粮中添加50 和100 mg·kg-1芦丁不会影响育肥湖羊瘤胃优势菌属Prevotella_1和Rikenellaceae_RC9_gut_group分布，这一结果与孙美杰等[23]研究结果中育肥湖羊瘤胃优势菌属的结果一致。Prevotella和Rikenellaceae_RC9_gut_group能够促进养分利用[20,27-28]。Prevotella_1 是Prevotella中主要的类群[29]，参与木聚糖发酵、半纤维素和果胶的降解以及蛋白质和多肽的代谢及丙酸的生成[2,30]。本试验研究发现，各处理组中Prevotella-1 占比最高，这与之前报道的瘤胃液中优势菌为普氏菌属[20,31]的结果相一致，但添加50 和100 mg·kg-1BW 的芦丁组Prevotella-1分别较对照组分别提高了29.39%和32.10%，这有利于促进瘤胃发酵[2]。体外试验表明，芦丁能够提高饲料的降解率，降低CH4产量[32]。进一步通过体内试验证明芦丁能提高瘤胃碳水化合物发酵效率和瘤胃细菌合成蛋白质的能力，增加乙酸、丙酸和MCP 浓度[10]。以上结果表明，日粮中添加芦丁有利于提高瘤胃优势菌属Prevotella_1 的相对丰度，促进瘤胃氮代谢及对相关代谢产物的吸收利用[2]。

4 结论

在本研究条件下，添加日粮中添加芦丁能提高瘤胃液中拟杆菌门的相对丰度，降低瘤胃中厚壁菌门和变形菌门的相对丰度。添加100 mg·kg-1的芦丁能影响瘤胃微生物的α 多样性和β 多样性，并显著降低月形单胞菌属和琥珀酸属的相对丰度。