侯 博，王晨燕，陈秋勇，吴学敏，刘玉涛，王隆柏，周伦江

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意义】伪狂犬病（Pseudorabies，PR），又称奥耶斯基氏病（Aujeszky’s disease，AD），是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。伪狂犬病病毒属于疱疹病毒科（Herpesviridae）、α-疱疹病毒亚科（Subfamily Alphaherpesvirinae）、水痘疱疹病毒属（Varicellovirus），能够感染猪、牛、羊、小鼠、家兔、猫、犬等多种动物，猪是PRV 感染后可以存活的唯一物种，因此也是该病毒的贮存宿主。欧守杼等分别在20 世纪50-60 年代报道我国仔猪中发生猪伪狂犬病[1]，而PR 在我国第一次大规模暴发发生在20 世纪90 年代，表现为经典PR 症状，母猪流产及仔猪神经症状；PR 在我国第二次暴发发生于21 世纪初，呈现大规模暴发，表现为“流产风暴”，但20世纪90 年代以来，规模化猪场普遍使用Barthak-61 疫苗株，该病得到很好控制；2011 年10 月以来，PR在我国呈现第三次暴发，以高密度PRV 免疫猪场野毒阳性率高并伴有成年种猪及育肥猪的突然死亡[2]，并且席卷全国、快速传播，对中国养猪业造成了严重的影响，经我国多个研究团队的病原学研究证明为新发变异PRV 导致。因此迫切需要以新型变异PRV 毒株开发新的疫苗以防控该病的持续性发生。【前人研究进展】gE是PRV重要的毒力基因之一，缺少gE的PRV对神经系统的侵入能力下降，并且gE是PRV 在检测中首选的标志性基因，针对gE 抗体的血清学检测方法已经非常成熟，是经典的鉴别区分野毒感染或疫苗免疫的血清学方法。部分欧美国家对该病投入巨大的人力、物力及财力，通过gEELISA 鉴别诊断技术已经在家猪中净化和消灭了该病[3]。多年来，我国普遍采用gE 缺失的弱毒活苗免疫接种、野毒监测和净化等技术，该病得到有效控制，其发病和流行情况趋于稳定[4]。但是从2011 年10 月开始，我国大部分地区先后在Bartha-K61 免疫的规模化猪场再次暴发伪狂犬病，分离的变异PRV对于85 日龄的育肥猪也具有致死性，其主要特点为：（1）免疫过Bartha-K61 疫苗的怀孕母猪发生高流产率；（2）生长猪出现中枢神经系统紊乱并且高死亡率；（3）血清高gE阳性率[2,5-6]。【本研究切入点】2011 年以后分离的所有新发变异超强PRV毒株，与欧洲和美洲毒株或2000 年以前分离的中国传统株相比，在基因组序列上具有明显的变异[7]。近年来从我国不同地区分离了大量的新发PRV 毒株，包括HNX、ZJ01、HeN1、SMX、TJ、JS、HNB、HN1201、FJ-2012 等，而现有疫苗对新发变异毒株不能提供很好的保护，亟需以新发变异的PRV超强毒株开发新的PR 疫苗，以更好地控制和预防PR。【拟解决的关键问题】本研究以伪狂犬病毒新发变异FJ-2012 株的gE/gI基因缺失株作为疫苗种子毒，经扩大培养以甲醛灭活后与不同佐剂制成灭活疫苗免疫绵羊，免疫28 d 后经亲本强毒株FJ-2012 株攻击，对不同佐剂制备的灭活疫苗进行免疫效力比较，为制备有效的灭活疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

PRV 新发变异强毒FJ-2012 株及其gE/gI基因缺失株（FJ-2012ΔgE/gI株，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202025）由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存；BHK-21 细胞[生长液为10%胎牛血清（FBS）的DMEM，维持液为1% FBS 的DMEM]、pEGFP-N1 质粒、pBelo BAC II 质粒由本实验室保存。pCR®-Blunt II-TOPO®质粒和pUC19 质粒分别购自Thermo 公司和大连宝生物公司；FBS 购自Thermo 公司；佐剂ISA 206VG 和GEL02 购自赛彼科公司；白油、吐温80、司盘80 购自上海迈弘生物科技有限公司；体重15～20 kg 的健康、伪狂犬gB 抗体为阴性的绵羊购自福建某规模化养殖场；PRVgB和gE抗体检测试剂盒购自IDEXX公司。

高保真聚合酶AccuPrimeTMpfxDNA Polymerase、DMEM 培养基、低熔点琼脂糖、opti-MEM 培养基、转染试剂lipofectamine®2000、DMSO 均购自Thermo公司；T4 DNA 连接酶、限制性内切酶EcoRⅠ、SacⅠ、HindIII、PstⅠ、PacⅠ、SphI 和碱性磷酸酶（CIP）均购自NEB 公司；2×PCR preMIX 购自广州东盛生物公司；病毒DNA 提取试剂盒和质粒提取试剂盒购自Qiagen 公司；DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。试验所使用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 同源重组转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 的构建

通过分子生物学技术将FJ2012 株gE/I基因的上下游同源片段依次插入到质粒pUC19 构建pUC19:H1:H2，再插入EGFP 表达盒和BAC 序列，构建用于同源重组的转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2。以FJ2012基因组DNA 为模板，按照文献[8]中的引物序列和方法构建pUC19:H1:H2 质粒。用限制性内切酶HindIII 和PstⅠ对pUC19:H1:H2 双酶切鉴定，酶切后预期片段大小约为4 000 bp 和1 100 bp；将鉴定正确的质粒保存备用。

按照文献[8]中的引物EGFP-F 和EGFP-R 使用AccuPrimeTMpfxDNA Polymerase 以pEGFP-N1 为 模板扩增EGFP 表达盒，参照文献[8]依次将EGFP 表达盒和pBelo BAC II 质粒采用合适的限制性内切酶酶切后插入到pUC19:H1:H2，将鉴定正确的质粒命名为pUC19:H1:EGFP:BAC:H2，并保存备用。将鉴定构建正确的质粒参照文献[8]的方法转染BHK21细胞，验证质粒是否正确并产生荧光以及转染效率。

1.3 构建gE/gI 缺失的重组病毒FJ2012ΔgE/gI

参照文献[8]的方法，提取FJ2012 毒株的基因组感染性DNA，与转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 共转染BHK-21 细胞，筛选并进行噬斑纯化，选取具有稳定的荧光斑病毒，命名为rPRV FJ2012 ΔgE/gI:EGFP+:BAC+。提取重组病毒基因组DNA 为模板，以文献[8]中的PRV-gE-632-F 和PRV-gE-632-R 引物进行PCR 扩增，对噬斑纯化后的重组病毒是否含有野毒进行鉴定。

提取重组病毒rPRV FJ2012ΔgE/gI:EGFP+:BAC+的感染性基因组与转移质粒pUC19:H1:H2 共转染BHK-21细胞，通过噬斑纯化筛选到gE/gI基因缺失、不含有EGFP 和BAC 序列的无痕重组病毒，命名为FJ2012ΔgE/gI株。对FJ2012ΔgE/gI重组病毒进行稳定性传代测定，连续传代20 代，观察每个代次之间的细胞病变，并且对P1、P5、P10、P20 代的病毒进行滴度TCID50测定，评价FJ2012ΔgE/gI重组病毒的遗传稳定性。

1.4 疫苗制备所用病毒液的增殖与灭活

采用静置培养的方式，对FJ-2012ΔgE/gI株按照常规病毒培养方式进行病毒大量增殖，增殖后冻融3 次，15 000 r·min-14 ℃下高速离心30 min 除去细胞碎片，收集上清作为灭活前抗原备用，并按照实验室常规方法测定TCID50。在上述备用抗原病毒液中缓慢加入适量的10%甲醛，使甲醛终浓度为0.1%，摇匀后全部转移到一个新的无菌三角瓶中，在37 ℃条件下灭活36 h，灭活过程中于200 r·min-1不断振荡，使灭活完全。灭活结束后，取灭活后病毒液5 mL，分别接种5 瓶长满单层的BHK-21 细胞（25 cm2），每瓶1 mL，37 ℃继续培养7 d，观察是否有细胞病变出现，并盲传3 代，确定病毒灭活完全。

1.5 灭活疫苗制备

1.5.1 水相佐剂灭活疫苗的制备和检验 准备75 mL的佐剂GEL02 和425 mL 灭活的水相抗原，将盛放水相抗原的烧杯置于搅拌器下，搅拌速度200 r·min-1，向水相抗原中加入佐剂相，200 r·min-1搅拌10 min后，20 ℃静置过夜，将制备好的疫苗分装于玻璃瓶中，进行性状检验，另分别储存在3 个温度（4 ℃、20 ℃、37 ℃）下，进行稳定性观察，其余保存于4 ℃备用。

1.5.2 油佐剂灭活疫苗的制备和检验油相制备 添加适量司盘-80 到400 mL 白油中，在60 ℃条件下充分搅匀，115 ℃高压灭菌15 min。水相制备：将适量的吐温-80 缓慢加入到160 mL 灭活后的PRV 病毒液中，搅拌使吐温-80 充分溶解并混匀。乳化：含368 mL的油相烧杯转移到乳化机下，调整乳化机转速11 000 r·min-1，混合油相15 s，将上述水相抗原加入到油相中，乳化机在＜25 ℃下，11 000 r·min-1乳化7 min后停止，进行性状检验，观察疫苗色泽，另取一洁净吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，应呈油滴状不扩散；取3 mL 乳化后样品在20 ℃下，1 570 g 离心15 min 应无明显分层；在37 ℃左右条件下放置21 d 应不破乳，其余保存于4 ℃备用。

1.5.3 双相佐剂灭活疫苗的制备和检验 准备200 mL的双相佐剂ISA206VG 和200 mL 灭活的水相抗原，在31 ℃水浴锅将两相分别加热30～40 min，将装有佐剂的烧杯置于搅拌器下，搅拌速度350 r·min-1，从水浴锅中拿出加热后的水相抗原，擦干烧杯外壁，向佐剂中快速加入水相（约3 s），350 r·min-1搅拌5 min 后，停止搅拌冷却，在20 ℃静置1 h，疫苗制备完毕后室温放置过夜。将制备好的疫苗分装于玻璃瓶中，进行性状检验，另分别储存在4 ℃和20 ℃下，进行稳定性测定，其余保存于4 ℃备用。

1.6 不同灭活疫苗的免疫效力试验

将25 头体重15～20 kg 的绵羊分5 组，每组5头，其中3 组分别使用GEL02 佐剂灭活疫苗、ISA 206VG 佐剂灭活疫苗和白油佐剂灭活疫苗以颈部皮下注射方式免疫疫苗5 mL，免疫4 周后连同对照组以皮下注射的方式每头感染强毒FJ-2012 株病毒液1 mL（含病毒104TCID50），另设阴性对照组。免疫前和攻毒前均采血分离血清，采用ELISA 方法测定gB和gE抗体；免疫后观察动物免疫应激反应情况，包括是否出现死亡、变态反应、接种部位脓肿等现象；攻毒后观察动物精神状态以及是否发病，包括是否啃咬接种部位，接种部分是否发生溃烂，是否出现神经症状，记录发病死亡情况。攻毒后连续观察14 d。

2 结果与分析

2.1 同源重组转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 的构建及验证

以FJ2012 株DNA 为模板，扩增gE/gI基因上下游同源臂H1 和H2 片段，经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定扩增结果与预期相符，预期片段大小分别为1 135 bp和1 163 bp，将H1 和H2 片段先后插入到pUC19 质粒中，构建pUC19:H1:H2 质粒。将构建好的pUC19:H1:H2质粒用限制性内切酶HindIII 和PstⅠ进行双酶切鉴定，酶切后片段大小预期为4 000 bp 和1 100 bp，酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测构建的pUC19:H1:H2 质粒正确。

将EGFP 表达盒从pEGFP-N1 质粒上扩增后，经限制性内切酶PacⅠ酶切后插入到pUC19:H1:H2 质粒，用EGFP-D-F 和EGFP-D-R 引物进行PCR 鉴定，其扩增结果与预期大小339 bp 相符，然后将鉴定正确的pUC19:H1:EGFP:H2 和pBelo BAC II 质粒经限制性内切酶SphI 酶切后，将二者连接克隆，用BAC-D-F 和BAC-D-R 引物进行PCR 鉴定，其扩增结果与预期大小390 bp 相符，将鉴定正确的质粒命名为pUC19:H1:EGFP:BAC:H2。

将构建正确的转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2转染细胞BHK-21 后，在细胞中观察其转染效率和是否产生荧光，验证其是否可以作为构建PRV 基因缺失株的同源重组质粒。结果表明pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 经转染BHK-21 细胞后可以使细胞产生荧光（图1），且转染效率较高，可作为同源重组转移质粒。

图1 转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 转染BHK-21 细胞荧光性的鉴定Fig. 1 Green fluorescence of pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 plasmid transfected into BHK-21 cell

2.2 gE/gI 基因缺失病毒FJ2012ΔgE/gI 的构建与鉴定

经过第一次同源重组和噬斑纯化，成功筛选到含有荧光标记的gE/I基因缺失的重组病毒rPRVFJ2012 ΔgE/gI:EGFP+:BAC+，在明场下可以观察到相应的细胞病变（图2）。以荧光重组病毒基因组DNA为模板，以PRV-gE-632-F 和PRV-gE-632-R 引物对重组病毒进行PCR 鉴定，结果表明gE/gI基因已经被转移质粒的相应序列替换。经第二轮同源重组和噬斑纯化，成功筛选到gE/I基因缺失、不含有EGFP和BAC 序列的无痕重组病毒rPRV-FJ2012ΔgE/gI，在荧光显微镜下无荧光，在明场下可以观察到明显的细胞病变（图3），以PRV-gE-632-F 和PRV-gE-632-R引物扩增序列经PCR 鉴定，结果表明gE/gI基因缺失成功，将鉴定正确的病毒命名为FJ2012ΔgE/gI。对重组病毒传代稳定性测定发现P1、P5、P10、P20 代病毒的TCID50分别为108.3·mL-1、108.5·mL-1、108.6·mL-1、108.4·mL-1，与亲本株FJ2012株（108.0～8.5·mL-1）无明显差异，表明重组病毒具有良好的遗传稳定性。

图2 pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 与PRV FJ-2012 毒株感染性DNA 共转染BHK-21 细胞后形成的带有EGFP 序列的rPRV:EGFP+:BAC+重组病毒Fig. 2 Plaques of recombinant PRV rPRV- FJ2012ΔgE/gI:EGFP+:BAC+ from pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 plasmid and PRV FJ2012 strain DNA co-transfected into BHK-21 cells

图3 pUC19:H1:H2 与rFJ-2012-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+毒株的感染性DNA 共转染BHK-21 细胞后形成的删除EGFP:BAC 序列的rPRV FJ-2012-ΔgE/gI 重组病毒Fig. 3 Plaques of recombinant PRV- FJ2012ΔgE/gI from pUC19:H1:H2 plasmid and rPRV- FJ2012ΔgE/gI:EGFP+:BAC+ strain DNA co-transfected into BHK-21 cells

2.3 制苗用病毒液的滴度测定和灭活效果

将收获的PRV FJ-2012ΔgE/gI株病毒液混匀后测定的TCID50为107.8·mL-1，基本达到制备灭活疫苗的要求。灭活后的病毒液在BHK-21 细胞盲传3 代均不出现CPE，表明病毒经0.1%的甲醛在37 ℃下36 h灭活完全。

2.4 不同佐剂的灭活疫苗制备及检验

制备的水相佐剂（GEL02）灭活疫苗，外观呈淡粉红色乳剂；将少量疫苗滴于冷水中，液滴扩散到水中；在4 ℃和20 ℃下存放30 d，无析出和分层现象，结果表明灭活疫苗剂型正确、乳化充分、稳定性较好，符合规定要求。制备的油佐剂灭活疫苗，外观为乳白色的乳剂；将少量疫苗滴于冷水中，呈油滴状不扩散；1 570 g 离心15 min 无明显分层；在37 ℃左右条件下放置21 d 不破乳，结果表明制备的油佐剂灭活疫苗剂型正确、乳化充分、稳定性较好，符合规定要求。制备的双相佐剂（ISA 206VG）灭活疫苗，外观呈淡粉红色乳剂；将少量疫苗滴于冷水中，呈云雾状扩散；在4 ℃和20 ℃下存放30 d，无析出和分层现象，结果表明灭活疫苗剂型正确、乳化充分、稳定性较好，符合规定要求。对制备的3 种灭活疫苗按照《中国兽药典》（2015 版）进行无菌检验，均无菌生长。

2.5 不同佐剂的FJ-2012ΔgE/gI 株灭活疫苗的免疫效果及抗体检测结果

将制备的3 种不同剂型的灭活疫苗以每头皮下注射5 mL 的方式免疫绵羊后，仅有1 头绵羊出现了过敏变态反应，其他接接种绵羊均无不良反应发生。将免疫前和免疫后28 d 采集的血清进行ELISA检测，5 组所有绵羊免疫前的血清gB和gE抗体均为阴性，表明无PRV 感染。免疫28 d 后3 个免疫组绵羊的gB抗体全部为阳性，gE抗体全部为阴性（表1），结果表明疫苗接种效果良好，疫苗株gE/gI基因缺失完全。在免疫28 d 后，连同一组对照组使用PRV FJ-2012 株以每头104TCID50的剂量感染后观察14 d，阳性感染组绵羊在感染后4～5 d 全部死亡，而GEL02佐剂疫苗组和白油佐剂疫苗组的绵羊全部存活，保护率为100 %，ISA 206VG 佐剂疫苗组免疫绵羊死亡2 头，保护率仅为60%，阴性对照组全部健存，其中死亡的动物在接种部位均出现啃咬或瘙痒以及四肢划水样等典型的伪狂犬病毒感染症状。表明以GEL02 佐剂和白油佐剂制成的FJ-2012ΔgE/gI株灭活疫苗免疫绵羊后可以抵御变异毒亲本株FJ-2012 株的攻击。

表1 PRV FJ-2012ΔgE/gI 株不同佐剂灭活疫苗免疫绵羊28 d后ELISA 测定血清gB 和gE 抗体结果Table 1 gB and gE antibodies in sheep vaccinated by different inactivated PRV FJ-2012ΔgE/gI vaccines detected using IDEXX ELISA kit

3 讨论

我国在2011 年以前使用Bartha-K61 疫苗株或本地gE缺失弱毒苗使PR 得到了很好的控制[4]。然而从2011 年10 月开始，我国从不同流行地区规模化猪场分离到的PRV 均表现出毒力增加[6]，对育肥猪和仔猪的致病性也增加，并且可以引起育肥猪的死亡，现有疫苗对新发变异株不能提供很好的保护[9]。与经典的PRV 毒株相比，糖蛋白gB 的变异导致PRV变异株JS-2012 和Bartha-K61 的免疫原性不同，序列分析表明新发的PRV变异株JS-2012 的gB基因与疫苗株Bartha-K61 相比具有多个变异位点[10]。与欧洲和美洲毒株或2000 年以前分离的中国传统毒株相比，在基因组序列上具有明显的变异[7]，为新发变异的PRV 超强毒株，包括HNX、ZJ01、HeN1、SMX、HNB、HN1201 和FJ-2012 等[2,5,7,9,11]。为了有效应对新发变异PRV 的感染，我国许多研究团队均开展了中国变异PRV 毒株的基因缺失疫苗研究[12-15]。本研究以福建本地PRV 分离株FJ-2012 为亲本株，通过构建gE/gI基因缺失株后制备不同佐剂的灭活疫苗，在绵羊上评估灭活疫苗的安全性和有效性。

YU等通过构建两株PRV嵌合病毒BJB（Bartha-K61 +JS-2012gB）和JBJ（JS-2012-ΔgE/gI+Bartha-K61gB），使用灭活的BJB 和JBJ 对小鼠进行免疫，使用JS-2012 毒株攻毒表明BJB 能够增加保护力到80%，而Bartha-K61 的保护力只有40%，JBJ的保护效果只有65%，而JS-2012-ΔgE/gI毒株的保护力能够达到90%，表明gB基因的交换可以显著改变重组病毒的免疫原性[10]。新发变异毒株TJ 缺失gE/gI基因后对于猪是无致病性，而对绵羊具有毒力[12]。本研究对分离于福建的新发变异PRV 病毒FJ-2012 株采用同源重组的方法成功构建了具有gE/gI基因缺失标记的伪狂犬病疫苗候选株FJ-2012ΔgE/gI，并以此为种毒甲醛灭活后利用商品化的白油佐剂、水相佐剂、双相佐剂制备了不同剂型的PRV FJ-2012gE/gI基因缺失灭活疫苗。结果表明以FJ-2012ΔgE/gI疫苗候选株制备的灭活疫苗能够采用gE-ELISA 的方法鉴别疫苗接种和野毒感染，并且以水相佐剂GEL02和白油佐剂制备的FJ-2012ΔgE/gI灭活疫苗其免疫保护效力较高。

因此，本研究构建的PRV FJ2012 毒株的gE/gI基因缺失株具有良好的遗传稳定性，以其作为抗原病毒与合适的佐剂制成灭活疫苗，可以对新发变异毒株的感染提供完全保护效果，为我国新发变异PRV 的防控提供了新的技术参考。