宋莉萍，耿启华,2，汤利光，王斌才，高长斌，余楚英，林处发，汪爱华

（1. 武汉市农业科学院，湖北 武汉 430070；2. 华中农业大学，湖北 武汉 430070）

维生素C（VC）又叫抗坏血酸，是一种水溶性维生素，分子式为C6H8O6。它是人体需要量最大的一种维生素，正常情况下，成人体内VC 含量约为1 500 mg，最高可达3 000 mg。它对维持人体生理机能意义重大。由于其高效的抗氧化性，VC 在人类机体的健康发育及疾病预防中发挥着不可或缺的作用[1]。当人体严重缺乏VC 时会引起坏血病，还会导致人体免疫力下降。人体所需的绝大多数其他维生素膳食推荐供应量都在20 mg/d 以下，而VC 的膳食推荐供应量却为100 mg/d[2]，但人体因缺乏古洛糖内酯氧化酶，不能自身合成VC，只能从水果和蔬菜中摄取[3]，由于VC 在身体内不能积累，所以每天都需要吃适量的蔬菜和水果。因此，VC 含量的多少与果蔬的品质、营养价值、抗病及抗衰老能力直接相关。

常态下VC 不稳定，容易被氧气及Cu2+、Fe3+等金属离子氧化，也易受温度、pH 值、光照等的影响。根据不同的原理，VC 含量的测定方法有很多种，一般包括紫外分光光度法[4]、荧光法[5]、碘量法[6]，比色法（2,4-二硝基苯肼比色法）[7]、滴定法（碘酸钾滴定法、2,6-二氯靛酚钠滴定法）[8-9]等，但大多存在操作繁琐、测定效率不高等问题。近年来，高效液相色谱法由于其高效、快速、稳定可靠等特点，被广泛应用于果蔬、食品、药物等的VC 含量测定[10]。笔者在现行标准（GB5009.86—2016 食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定）的基础上，借鉴王超等[11]高效测定油菜中VC 含量的方法，对高效液相色谱法测定VC 含量进行了优化，可满足蔬菜中VC 含量测定的高通量、高准确率要求。

十字花科蔬菜是蔬菜体系中的一大类，主要包括白菜类、甘蓝类、芥菜类、萝卜类、水生蔬菜类和油菜。白菜类包含小白菜、菜心、大白菜、紫菜薹、红菜薹等；油菜和白菜有许多变种，如塌菜、乌菜之类都属于这一族，它们颜色深绿，炒食后味道浓香，都属于优质蔬菜。小白菜叶和油菜幼苗及其薹中都含有丰富的VC，具有很高的食用价值。该研究选择6 种不同类型的十字花科蔬菜进行叶和薹的VC 含量测定，旨在为培育高VC 含量的十字花科类蔬菜品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试样品如表1 所示，2020 年9 月15 日将搜集到的不同来源的白梗小白菜（9 份）、青梗小白菜（29 份）、乌塌菜（13 份）、快菜（5 份）、油菜（12 份）、红菜薹（8 份）共76 份资源播种于穴盘中，9 月29日移栽到武汉市农业科学院北部院区武湖试验基地，11 月2 日于试验田中编号挂牌并采样，每个材料选择9 株大小相近的、由内往外数的第4 片叶，取3 株的叶混合为一个样品，每份资源取3个样，2020年12月—2021 年2 月在各类型材料的花蕾期进行薹取样（每种蔬菜薹的取样时间均处于可食用状态），选择与叶编号相对应的主薹，液氮迅速冷冻，并于-80℃保存备用。

表1 供试样品及来源

1.1.2 仪器与试剂主要仪器设备有高效液相色谱仪（e2695，美国Waters 公司）、色谱柱（美国Waters XBridge-C18 色谱柱，柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm）、PDA 检测器（美国Waters2998，紫外检测器）、超声波清洗机（ SB25-12DTN，宁波新芝生物科技股份有限公司）、磨样机（ MFJ-W300，利仁电器京东自营）、真空抽滤装置（ VP-10L，JOAN LAB 公司）。主要试剂有VC 标准品（纯度99%以上，Sigma-Aldrich公司）、偏磷酸（国药集团化学试剂有限公司）、乙酸铵（Sigma-Aldrich 公司）、色谱甲醇（Fisher 公司）、2 mL 色谱进样瓶和250 μL 内插管（上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 VC 标准工作液配制称取0.1 g VC 标准品于100 mL 棕色容量瓶中，用1%的偏磷酸溶解并定容，充分摇匀后放置在4℃冰箱中避光保存。分别吸取1、2、5、10、20 mL 的VC 标准溶液（1 000 μg/mL）于容量瓶中，用1%的偏磷酸定容至100 mL，由此获得浓度为10.0、20.0、50.0、100.0 和200.0 μg/mL 的VC 标准工作液。

1.2.2 VC 的提取取出样品在液氮中预冷，再置于磨粉机中研磨成粉状；用万分之一的天平称取2 g 样品，置于50 mL 离心管中，加入40 mL 提取液（即1%的偏磷酸），然后用均质机均质破碎；用10 mL 注射器吸取样品匀浆，经0.45 和0.22 μm 2 层滤膜过滤；将滤液打入2 mL 色谱进样瓶中，等待上机检测。

1.2.3 HPLC 检测条件流动相为甲醇和20 mmol/L乙酸铵（2 者比例为7 ∶93；其中，乙酸铵溶液现配现用，称取1.54 g 乙酸铵，先溶解于200 mL 超纯水中，超声15 min 后，再用超纯水定容至1 000 mL，继续超声脱气15 min，超声结束后用真空抽滤泵+0.22 μm 微孔水相滤膜进行抽滤）；流速 1.0 mL/min；进样量10 μL；目标柱温25℃；检测波长245 nm；VC 的保留时间2.5 min。

2 结果与分析

2.1 VC 标准曲线的绘制

由图1 可以看出，在10～200 μg/mL 浓度范围内，VC 含量呈现出良好的线性关系，所得方程为y=20 566.9x+2 753，相关系数R2=0.999 885，可以满足测定要求。

图1 VC 的标准工作曲线

2.2 检测方法的稳定性和重复性

取同一小白菜叶片样品在相同试验条件下重复测定6 次，VC 含量分别为84.53、85.45、86.57、87.60、88.49 和89.09 mg/100g，这一小白菜叶片VC 含量的平均值为86.96 mg/100g，相对标准偏差RSD 仅为1.8543%，说明该检测方法稳定性和可重复性较好，如图2 所示，VC 的保留时间为2.464 min。

图2 样品中VC 的色谱图

2.3 各样品的VC 含量

2.3.1 小白菜类如图3 所示，白梗小白菜叶的VC含量在77.16～123.58 mg/100g 之间，平均值为103.13 mg/100g，白梗小白菜薹的VC 含量在54.22～90.98 mg/100g 之间，平均值为77.81 mg/100g；青梗小白菜叶的VC 含量在59.39～111.57 mg/100g 之间，平均值为94.11 mg/100g，青梗小白菜薹的VC 含量在54.21～102.87 mg/100g 之间，平均值为79.01 mg/100g。

2.3.2 乌塌菜如图4 所示，乌塌菜叶中VC 含量在58.41～141.24 mg/100g 之间，平均值为89.37 mg/100g，薹中VC 含量在56.32～115.69 mg/100g 之间，平均值为78.33 mg/100g；其中，XJ668、XJ827、XJ838 这3份材料中薹的VC 含量比叶高；其他10 份材料中薹的VC 含量比叶低。这种差异的产生可能是地域不同所致，也可能是品种不同所致。

图4 乌塌菜中叶和薹的VC 含量

2.3.3 快菜、红菜薹及油菜由图5A 可知，快菜叶中VC 的含量在49.71～111.69 mg/100g 之间，平均值为74.05 mg/100g；薹中VC 的含量在75.11～91.75 mg/100g 之间，平均值为77.37 mg/100g，薹的VC含量均比叶高。由图5B 可知，红菜薹叶中VC 的含量在69.53～103.02 mg/100g 之间，平均值为87.78 mg/100g；薹中VC 的含量在43.15～86.35 mg/100g 之间，平均值为69.98 mg/100g。由图5C 可知，油菜叶中VC 的含量在51.48～113.19 mg/100g 之间，平均值为81.48 mg/100g；薹中VC 的含量在74.20～104.78 mg/100g 之间，平均值为89.50 mg/100g。快菜中薹的VC 含量高于叶，可能是受生育期长短的影响，快菜作为早熟的大白菜，其生长周期短，叶中营养物质的积累相对普通小白菜要弱一些。不同生长时期、水肥供应、光照时长等也可能是造成叶和薹中VC 含量差异的原因。

图5 快菜、红菜薹及油菜中叶和薹的VC 含量

3 讨论与结论

3.1 结 论

利用高效液相色谱法测定了6 种类型十字花科蔬菜共76 份资源叶和薹的VC 含量，结果显示，不同材料的VC 含量差异较大；食用叶中，VC 含量的均值由高到低依次为白梗小白菜＞青梗小白菜＞乌塌菜＞红菜薹＞油菜＞快菜；食用薹中，VC 含量的均值由高到低依次为油菜＞青梗小白菜＞乌塌菜＞白梗小白菜＞快菜＞红菜薹。青梗小白菜和白梗小白菜的叶VC 含量均高于薹；乌塌菜、油菜和红菜薹中大部分资源的叶VC 含量高于薹，少部分资源薹VC 含量高于叶；5 个快菜资源的薹VC 含量均高于叶。

3.2 讨 论

VC 作为维持机体生理功能的重要维生素之一，对人体健康有着非常重要的意义。目前采用的国标中的高效液相色谱法样品前处理比较繁琐，一个样品从处理到上机检测至少需要15 min，对于大群体样本测定效率不高。因此，实验借鉴了王超等[11]的方法，进一步优化了十字花科蔬菜VC 含量测定的高效液相色谱法，样品中VC 提取步骤简单，1%偏磷酸提取比1%盐酸提取更稳定，基本没有其他杂峰出现，而且出峰时间可稳定在2.5 min 左右，重复性好，准确度高，可满足蔬菜中VC 含量测定的高通量、高准确率要求。

随着人民生活水平的日益提高，蔬菜的营养品质及口感越来越受到重视。十字花科蔬菜可提供人体所必须的多种矿物质和维生素等营养物质，水溶性VC可在体内形成一种“透明质酸抑制物”，这种物质具有抗癌作用，可使癌细胞丧失活力[12]。目前已有关于黄瓜[13]、番茄[14]、辣椒[15]、拟南芥[16]中VC 遗传的分析，但是很少有关于十字花科蔬菜的遗传机理的研究报道。VC 作为蔬菜品质性状中的重要指标，其含量的快速准确测定有助于其遗传机理的解析，以便挖掘高VC 含量的十字花科蔬菜种质，加快培育高VC含量新品种，为以新需求为导向的十字花科蔬菜产业发展战略以及提高十字花科蔬菜的叶用和薹用价值奠定基础。