林放 周谋 李文丹 孙宇 骆美良 单桂秋

慢性难愈性创面主要包括压疮、糖尿病足溃疡、创伤性溃疡及下肢动静脉溃疡，创面感染是慢性难愈性创面持久不愈的重要原因之一[1]。目前主要使用换药、超声波、高压氧、局部灌洗等非手术治疗方法，同时使用抗菌药物进行联合治疗[2]，但治疗效果不如人意。因此，有必要寻找一种更加安全和有效的抑菌治疗方法。

富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是继富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）之后的第二代富血小板浓缩物，富含生长因子、抗菌肽和纤维蛋白原等。PRF对单一菌的抑菌作用已被大家认可，但对混合菌的抑制作用尚未见报道。为此，本研究通过体外实验，研究PRF对金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合菌的体外抑菌效果，为下一步PRF治疗合并感染的慢性难愈性创面提供理论依据。

材料与方法

1 材料 大肠杆菌Escherichia coli（ATCC25922）和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus（ATCC292-13）购自广东省微生物菌种保藏中心；氨苄西林购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； Luria-Bertani medium（LB）肉汤、LB琼脂、tryptone soy broth（TSB）肉汤购自广东环凯微生物科技有限公司。

2 仪器和试剂 全自动血细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号BC-3000），恒温恒湿培养箱（上海精宏实验设备有限公司，型号HWS-250），厌氧罐（北京恒奥科技有限公司，型号AG015），扫描电镜（德国蔡司，Zeiss Ultra 55），超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，型号SW-CJ-1FD），高速离心机（Eppendorf Centrifuge 5804）。

3 富血小板血浆的制备

3.1 用EDTA抗凝采血管分别采集4名志愿者静脉血20 mL（每管10 mL），分别制备PRP；献血者在实验前1个月内未服用抗菌药物；没有接受抗凝或免疫抑制治疗；抽血前签署知情同意书。

3.2 用离心机使用富浆法分离血小板，第一次510 g离心10 min。离心结束后，在超净台内分离红细胞上方富含血小板和白细胞的血浆，并对第一次离心后获得的PRP进行血小板计数检测。

3.3 根据检测结果将第一次离心获得的PRP分成两部分，一部分进行第二次离心，另一部分留作重悬血小板。

3.4 第二次220 g离心20 min，离心结束后，在超净台内将上清转移至一干净离心管，获得贫血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP）；将剩余血小板沉淀用留置的PRP进行重悬，充分混匀后获得PRP，并进行血细胞计数。

3.5 通过计数，用PPP调节PRP的血小板数量为800×109/L。

3.6 用葡萄糖酸钙和凝血酶冻干粉按1 mL∶100 U配比混匀，得到混合液。

3.7 将PRP和上述混合液按1∶10配比混合，制成PRP凝胶。

3.8 将PRP凝胶静置在培养皿中，30 min后收凝胶析出液。

3.9 用血细胞分析仪检测全血和析出液中白细胞和血小板含量。

4 富血小板纤维蛋白的制备

4.1 同时抽取上述4名志愿者静脉血各10 mL于真空干燥管，立即转入离心机，3 000 g离心12 min。

4.2 离心后取出，此时离心管内分为三层，上层为血清，中间层为PRF，底层为红细胞。静置5～10 min后吸去最上层的贫血小板血浆，并剪去最下层的红细胞层，获得PRF。

4.3 将其静置在培养皿中，30 min后收集PRF析出液。

4.4 将分别制备的PRF析出液进行混合，用血细胞分析仪检测PRF析出液中血小板和白细胞含量。

5 氨苄西林溶液的制备 将氨苄西林溶于纯水，配制成浓度为2 μg/mL的氨苄西林溶液。

6 菌种培养及鉴定

6.1 菌种的培养：分别用TSB肉汤和LB肉汤培养金黄色葡萄球菌和大肠杆菌至生长对数期，然后分别重悬于生理盐水中，用麦氏比浊仪分别将两种菌液浓度调节为0.5麦氏单位（即1.5×108CFU/mL）后，按1∶1比例混合调整浓度至OD595=0.5，用扫描电镜鉴定菌种混合情况。

6.2 混合菌的鉴定

6.2.1 将菌液进行离心，5 000 r/min离心3 min，去上清，加2.5%的戊二醛溶液1 mL，充分混匀，重悬菌液，4 ℃固定4 h。

6.2.2 再次离心，5 000 r/min离心3 min，去上清，加入500 μL PBS 漂洗混合菌菌体3次，每次15 min；加1%锇酸500 μL，充分混匀，固定2 h后，5 000 r/min离心3 min，去上清，加入500 μL PBS 漂洗混合菌菌体3次，每次15 min。

6.2.3 用梯度浓度分别为20%、50%、80%、100%的乙醇溶液脱水，每种浓度处理10 min，5 000 r/min离心3 min，去上清。

6.2.4 加入200 μL 100%叔丁醇，4℃放置20～30 min后，5 000 r/min离心3 min，再加入200 μL 100%叔丁醇，漂洗混合菌菌体3次，每次15 min。最后进行涂片。

6.2.5 涂片自然风干，密封4℃保存，等待上样鉴定。

6.3 抑菌效果的鉴定：在无菌培养皿中加入15 mL 50℃的LB琼脂固体培养基，冷却至室温凝固后，将上述菌液均匀涂布在固体琼脂表面。然后将已灭菌的牛津杯慢慢放置于培养皿的适当位置。将200 μL生理盐水（对照组）、氨苄西林溶液、PRP凝胶和PRF分别加入到牛津杯中，置于37℃恒温恒湿培养箱培养24 h，取出观察结果（图1）。

图1 牛津杯打孔-预加菌液倾注平板

7 结果判读 用标准游标卡尺测定各组的抑菌圈直径，评价不同物质的抑菌能力。参考抗菌药物药敏试验等级划分[全国临床检验操作规程（第三版）]判断标准判断药敏实验结果。抑菌圈的直径＞20 mm为极度敏感，抑菌圈的直径15～20 mm为高度敏感，抑菌圈的直径10～15 mm为中度敏感，抑菌圈的直径＜10 mm为低度敏感，无抑菌圈则为不敏感。

8 统计方法 使用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，抑菌圈直径均数比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示有统计学意义。

结 果

1 血小板和白细胞含量的检测 用血细胞计数仪对4例PRF析出液、PRP凝胶析出液及全血中的血小板和白细胞分别进行计数，其血小板含量分别为（92.00±7.26）×109/L、（961.75±66.53）×109/L、（279.25±12.87）×109/L；白细胞含量分别为（1.08±0.39）×109/L、（0.10±0.00）×109/L、（5.65±1.24）×109/L，见图2。

图2 三组血小板和白细胞含量比较

2 混合菌中细菌的鉴定 混合菌接种于LB琼脂固体培养基培养24 h后取出，可检测到平板上同时有金黄色葡萄球菌和大肠杆菌（金黄色葡萄球菌形态为球形，大肠杆菌形态为短小杆菌）的菌落形成，说明已形成混合菌，见图3。

图3 平板上混合菌的扫描电镜图

3 PRF对混合菌的抑菌效果鉴定 由图4可见，PRF组、PRP凝胶和氨苄西林溶液的抑菌圈大小分别为（19.00±0.61）mm、（17.13±0.57）mm和（16.40±0.89）mm。抑菌圈直径均数比较采用单因素方差分析，F=10.903，P＜0.05。两组间比较采用LSD-t检验，PRF组与PRP凝胶组比较差异有统计学意义（P＜0.05），PRF与氨苄西林溶液组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。结果显示，三个实验组对混合菌的抑菌效果都属于高敏，但PRF对混合菌的抑菌效果最明显，见图5。

图4 各组抑菌圈直径均数比较

图5 各组抑菌效果（左：PRP凝胶；中：氨苄西林溶液；右：PRF）

讨 论

慢性难愈性创面有发病机制复杂、影响因素多、治疗难度大和病程时间长等特点，因此一直采用多种方法联合的方式进行治疗。我国的慢性难愈性创面发病率是外科总住院率的1.5%～3%，虽然比例不高，但也严重影响患者的生活质量，同时给患者家庭造成很大的经济负担[3]。

慢性难愈性创面的发病机制尚未完全明确，不同疾病、不同部位创面的发病机制存在较大差异，但共同点有局部微循环障碍、创面产生多种细菌、组织缺血缺氧、生长因子和活性物质异常、产生大量基质金属蛋白酶（MMPs）、组织再生能力差和细菌表现出对抗菌药物特异性或非特异性的耐受等。其中，创面产生多种耐药的细菌是慢性难愈性创面的主要影响因素[3]。有大量文献指出，在慢性难愈性创面中，检出率最高的病原菌有铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等[4-6]。其中，金黄色葡萄球菌感染的危害最大，其通过产生大量的黏附毒素、细胞毒素、侵袭性酶等毒性物质，溶解新生的上皮细胞、破坏皮肤黏膜组织、干扰人体的免疫机能，从而导致创面持久不愈[7]。大肠杆菌是创面形成假膜和浓苔的主要原因，常见于烧伤难愈创面[8]。有些创面的细菌是单一菌种，但更多的创面是混合菌种[9]，因此也更难愈合。

慢性难愈性创面的治疗通常是以多学科协同治疗为主，在改善基础疾病的同时，通过各种治疗方法加上抗菌药物联合治疗[10]。主要的治疗方法有非手术治疗方法和负压吸引技术（VSD）等。其中非手术治疗方法有超声波、高压氧、局部灌洗及人工光源辐射等[3]。随着新型敷料的开发应用，局部应用水凝胶敷料、含银离子抗菌敷料和中药制剂，是近几年受到临床医生关注的治疗方法，虽然都能起到一定抑菌作用，但是重复多次使用纳米银敷料，会存在银中毒的潜在风险[11]，而中药会因个体差异而导致疗效不稳定[12]。

开发合成抗菌肽（AMP）是国外治疗慢性难愈性创面耐药菌的研究热点之一，与内源性抗微生物肽相比，AMP具有更低的毒性和更高的活性，而且其显示出更加广谱的抗菌活性、低耐药率、免疫调节和促进伤口愈合的活性[13]。

PRP治疗慢性难愈性创面，是得到国内外临床医生认可的一种新兴治疗方法。PRP富含血小板、白细胞及抗菌肽，可改善难愈创面的免疫环境，降低感染和炎症。通过凝血酶和钙离子激活后，还可释放大量血小板源性生长因子（PDGF）、转化生长因子β（TGF-β）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）等，促进组织创面的修复。因其来源于自体，安全性高且制备方法简单，已在临床上广泛应用[14]。

PRF作为PRP的第二代血小板浓缩制品，由静脉全血离心浓缩制备而成，由于在制备过程中没有添加如凝血酶等其他外源性生物药剂，因此制备的成品规避了潜在传染病风险[15]。PRF富含与PRP相同的多种生长因子，也可促进细胞的迁移、增殖、分化，还能促进血管、神经的修复。PRF在激活后，会形成一种紧密高密度的立体三维纤维网状结构，使其释放的内容物以化学键的方式结合，在该结构中持续缓慢释放[16]。有文献报道，PRF的持续释放时间可达7～14 d[17]，而PRP在添加葡萄糖酸钙和凝血酶激活后，在10 min内会释放70%的生长因子，1 h内即几乎全部释放，作用时间较短[18]。

PRF除了能释放大量生长因子外，还可释放白细胞和多种抗菌肽[19]，因此对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等单一菌有抑制作用[20-22]，但对混合菌的抑菌效果却未见报道。因此，本次实验对慢性难愈合创面中常见的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行联合培养制成混合菌，并用PRF进行体外抗菌，以此验证其抑菌效果。

实验结果显示，PRP的血小板浓度约为全血的3.5倍，几乎不含白细胞；而PRF的血小板和白细胞浓度分别为全血的1/3和1/5。导致PRP和PRF血小板浓度不同的原因是PRP制备时可调节血小板浓度，而PRF不可；另一个原因是PRF的血小板和白细胞离心后，血小板和白细胞都负载到纤维蛋白网络中，因此不能完全在析出液中检测到。虽然PRF的血小板含量没有全血和PRP高，但抑菌效果却比PRP优异，抑菌圈直径比较有明显差异（P＜0.05），推断有以下两个原因：①PRF制备过程只需一次离心，弃去的纤维蛋白原相对较少，在相对高速的离心下其形成的纤维蛋白网络更加致密、稳固，不易被水解，从而使各种因子得以缓慢释放并发挥生物学作用；②PRF的纤维蛋白在自然凝集过程中可以网络大量白细胞和抗菌肽等物质，同时释放一定浓度的抗炎因子，使得抑菌作用更明显。

除此之外，PRF体外的抑菌效果也优于氨苄西林，这提示使用PRF在一定程度上可替代常规抗菌药物进行抑菌治疗，而且PRF来源于自体，没有添加任何外源物，在临床上使用更安全有效，且不会产生耐药性。

综上所述，PRF除了对单一菌有抑菌作用外，对慢性难愈性创面常见的混合菌也有良好的抑菌效果，我们下一步将进行难愈性创面的动物实验，进一步验证PRF的抑菌效果，为临床应用提供进一步的理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突