王静 胡艳 朱曼 胡芮维 张洪为 黄远帅

血小板是一种极为重要的血液成分。目前，常用的血小板制品有富血小板血浆、浓缩血小板和单采血小板等，其中单采血小板可以减少同种免疫反应的发生和血液传播性疾病的感染风险[1]。目前由于临床对于血小板的需求日渐增大，血小板制剂供不应求，并且血小板存在储存过程的形态、结构和代谢等不良变化，导致其体外的活化和血小板功能损伤，储存时间短，储存期质量下降影响输注效果，所以我们需要探索延长血小板储存期限以及增进血小板储存期质量的方法，以缓解临床用血小板紧张的问题。

血小板在体外采集和制备过程中，由于暴露于异物表面和高离心力等一系列机械因素引起血小板活化、碎裂；在储存过程中，血小板自身凋亡，血小板糖酵解增强和线粒体功能的降低导致血小板内乳酸堆积，血小板表面蛋白表达改变，血小板内免疫活性蛋白积累，这一系列的变化称为血小板储存损伤（platelet storage lesion，PSL）[2]。在低温条件下血小板可以产生可逆性的代谢减慢以减缓血小板保存期间的活化，并且降低了常温保存下易滋生细菌的风险[3]。但是低温会导致血小板发生低温损伤，输入人体后肝脏部位的巨噬细胞在2～3天内就会将血小板吞噬清除，血小板输注回收率降低，从而导致血小板输注无效（platelet transfusion refractoriness，PTR）[4-5]。

近年来许多研究人员从血小板保存添加剂中探索延长血小板保存期限和改善血小板质量的方法。其中有研究表明一氧化氮（nitric oxide，NO）能够抑制血小板活化从而增进血小板保存质量[6-8]。RADOMSKI MD等[9]研究发现NO能在一定程度上抑制血小板的活化聚集。目前已有NO水溶液和多种类型NO供体运用于NO对血小板作用机制的研究中，但是不同类型的NO供体的作用强度和具体机制尚不清楚。因此，本研究通过使用文献中尚无研究的多胺类NO供体四盐酸精胺来进行实验，用不同浓度的四盐酸精胺处理不同储存时间节点的单采血小板，检测其作用产生的NO含量、血小板活化标志物CD62p的表达以及两者的关系，初步探讨NO供体在血小板保存中的作用，报告如下。

材料与方法

1 血小板样本来源 由泸州市中心血站提供，采自三位健康献血者的保存1 d、3 d、5 d的单采血小板。

2 仪器与试剂 荧光/发光酶标仪（FLx800，Biotek 公司，美国）；流式细胞分析仪（FACS Salibur，BD公司，美国）；电子分析天平（AUW320，岛津公司，日本）；四盐酸精胺Spermine（批号：C11608259，毕得医药科技有限公司，上海）；PE Anti-human CD62p（货号：304906，兰博利德商贸有限公司，北京）；NO含量测定试剂盒（批号：20201216，齐一生物科技有限公司，上海）；PBS溶液（pH 7.35～7.45）。

3 实验样本处理 将储存1 d、3 d、5 d的血小板各自随机分装为A、B、C、D、E、F六个组，每组400 μL，设三组平行实验。用PBS溶液配制10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L五种不同浓度的四盐酸精胺溶液，向实验组A、B、C、D、E注射四盐酸精胺溶液各40 μL，其浓度依次为A组10 mmol/L、B组20 mmol/L、C组30 mmol/L、D组40 mmol/L、E组50 mmol/L，F组为对照组注入等量PBS溶液，设三组平行实验。所有操作均在生物安全柜内完成。

4 血小板NO浓度 采用一步法NO测定试剂盒测量血小板NO浓度。具体操作流程参照试剂盒说明书。

5 血小板活化标志物检测 PBS对照组和用不同浓度四盐酸精胺处理后的各实验组，在处理后的60 min时严格按照PE Anti-human CD62p试剂盒说明书采用流式细胞仪分别测定PBS对照组和各实验组血小板膜表面CD62p的表达率。

6 统计学方法 运用Stata15.0进行统计分析，GraphPad Prism8.0.1绘图。符合正态性的数值型变量采用均数±标准差进行描述。采用Shapiro-Wilk正态性检验考察数值型变量的正态性，Levene方差齐性检验考察数值型变量组间方差齐性。源自同一样本的血小板经多种浓度处理后，采用配伍组设计方差分析比较荧光强度和浓度，若多种处理间差异显著，则采用SNK法进行预先设定的组间两两比较。正态性检验和方差齐性检验的检验水准α=0.1（双尾），余检验水准均为α=0.05（双尾）。

结 果

1 血小板NO含量 同一样本的血小板经6种不同处理措施及不同存储时间（1 d、3 d和5 d）的NO含量变化趋势如图1所示。对于同一时间节点而言，采用配伍组设计方差分析对6种不同处理措施血小板的NO含量进行比较，表明6种处理措施间具有显著差异（F=489.88，P＜0.001），经SNK法进一步两两比较，见表1。相较于PBS对照组，四盐酸精胺处理后的血小板NO浓度均一定程度升高，差异具有统计学意义（P＜0.001）。四盐酸精胺浓度的变化对储存1 d、3 d和5 d的血小板NO浓度的影响具有统计学意义（P＜0.001）（图1）。血小板NO浓度随着四盐酸精胺浓度的增加而增加，对储存3 d的血小板作用最为显著。各四盐酸精胺浓度的实验组间在同一时间节点的NO浓度差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 不同浓度四盐酸精胺处理血小板NO浓度的SNK法两两比较

图1 不同浓度（mmol/L）四盐酸精胺处理血小板的NO浓度变化

3 血小板活化标志物（CD62p）的表达 不同浓度四盐酸处理不同储存时间（1 d、3 d和5 d）的血小板和对照组血小板CD62p表达的荧光强度变化趋势如图2所示：随着储存时间的增加而增多，储存5 d的血小板表达最多，差异有统计学意义（P＜0.05）。对于同一时间节点而言，采用配伍组设计方差分析对6种不同处理措施血小板的CD62p表达的荧光强度进行比较，表明6种处理措施间具有显著差异（F=924.64，P＜0.001），经SNK法进一步两两比较，见表2。在加入四盐酸精胺处理后，血小板CD62p表达均一定程度下降，与PBS对照组相比差异均具有统计学意义（P＜0.001）（图2）。随着四盐酸精胺浓度的增加，CD62p表达的抑制程度越强，到约40 mmol/L抑制程度趋于稳定，差异均具有统计学意义（P＜0.05）（图2）。用SNK比较法分析得到，40 mmol/L和50 mmol/L的四盐酸精胺对储存3 d、5 d的血小板CD62p表达的抑制作用差异无统计学意义（P=0.085；P=0.078，P＞0.05）（表2）。

表2 不同浓度四盐酸精胺处理血小板CD62p的SNK法两两比较

图2 不同浓度四盐酸精胺处理血小板的CD62P荧光强度变化趋势分析

讨 论

国内外由于临床对于血小板的需求量持续增加，供不应求，并且由于血小板质量受各种保存因素影响大，输血风险随着储存时间的增加而增大等情况，严重的血小板短缺正在持续增加[10-11]。

有研究发现NO在体内能激活血小板中的鸟苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase，sGC），sGC能够催化三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）生成环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP），从而参与一系列蛋白质的磷酸化反应的调节，抑制血小板活化和聚集[12]。我们的研究通过添加NO供体四盐酸精胺来探讨血小板NO与血小板活化标志物CD62p之间的关系，四盐酸精胺对血小板的作用及其可能的机制。

从本实验的PBS对照组血小板NO浓度检测结果可知，血小板NO浓度随着储存时间的增加而减少，这提示血小板离体后在储存期间NO逐渐被消耗。在不加入任何干扰剂的情况下，离开循环系统的血小板自身能够通过内源性途径生成NO，但NO的生成量是有限的。离开机体后，血小板不能从血管内皮细胞获取NO，随着储存时间的增加，NO逐渐被血小板消耗，所以血小板NO浓度逐渐降低。

CD62p又称为P-选择素，它在血小板活化期间转移到质膜[13]。我们的实验结果显示随着储存时间的增加，血小板膜表面的活化标志物CD62p表达逐渐增加，说明在存储期间血小板活化增强。通过我们的实验可知，随着储存时间增加，血小板NO浓度降低，CD62p表达增加，所以NO与CD62p表达之间可能存在对应的关系。因此，可以通过体外添加NO气体水溶液和NO供体等方式直接在体外向离体的血小板持续稳定地供给外源性的NO，以维持血小板储存期的生理调节，抑制储存期间血小板的活化。目前相关研究主要是用NO气体作为血小板外源性NO，而NO供体在一定条件下释放的NO也可作为血小板外源性NO。NO供体主要包括硝普纳、有机硝酸酯类及亚硝酸酯类等。在常温储存血小板期间加入NO供体S-亚硝基乙酰青霉胺能够在血小板代谢、乳酸生成和血小板活化率方面一定程度上减少PSL[14]。S-亚硝基谷胱甘肽作为另一种NO供体，同样能够在储存期间改善血小板代谢，减缓乳酸生成[15]。亚硝酸盐通过直接激活鸟苷酸环化酶和磷酸化磷酸蛋白Ser299独立于NO以及其他的血液成分如线粒体（白细胞）或血红蛋白（红细胞）等来抑制血小板聚集[16]。我们的研究通过添加NO供体四盐酸精胺来探讨血小板NO与血小板活化标志物CD62P之间的关系，四盐酸精胺通过鸟苷酸环化酶和磷酸化磷酸蛋白对血小板的作用及其可能的机制。

四盐酸精胺属于多胺类NO供体，在细胞增殖和信号转导中有着重要作用[17]。在本实验中加入四盐酸精胺后，A、B、C、D、E组相较于PBS对照组，血小板NO浓度均明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。四盐酸精胺的浓度越高，产生的NO的量越多，不同浓度组间NO浓度差异有统计学意义（P＜0.05），50 mmol/L时产生的NO最多。这说明NO供体四盐酸精胺能够在体外向血小板提供一定量的NO，并且与四盐酸精胺浓度有关，使其应用于血小板储存期间的生理调节。目前，NO供体在血小板储存中的运用也已开展多项研究得到证实[14]。额外添加适量的NO供体后，会产生更多的NO作用于血小板参与后续的抑制级联反应，从而改善储存期间血小板的保存质量。

本实验在加入NO供体四盐酸精胺后，血小板CD62p的表达相较于PBS对照组明显受到抑制，差异有统计学意义（P＜0.05），即这种NO供体可以抑制血小板的活化。从不同浓度的组别来看，CD62p的受抑制程度与四盐酸精胺的浓度有关，随着四盐酸精胺浓度增加，血小板CD62p表达减弱，差异有统计学意义（P＜0.05），在约30 mmol/L后CD62p表达趋于稳定。这表明四盐酸精胺对血小板活化的抑制作用在一定浓度范围内随着浓度的升高逐渐增强，超过一定浓度后抑制作用保持稳定。因此，浓度30 mmol/L左右可能是四盐酸精胺抑制血小板活化作用的最佳浓度。

血小板膜表面CD62p的表达率会影响血小板输注效果，CD62p表达率越高，血小板校正增加值（corrected count increment，CCI）越低，临床的输注效果越差[15]。因此，我们在用四盐酸精胺这种NO供体处理血小板制品后，可以一定程度上抑制血小板CD62p的表达，预测在临床输注这样处理后的血小板，可以降低输血并发症发生的风险，使临床血小板输注更为安全有效。

综上所述，四盐酸精胺能够在体外向血小板提供外源性的NO，从一定程度上抑制血小板CD62p的表达，并且这一现象与四盐酸精胺的浓度有一定的关系。我们的研究结果显示当NO浓度上升到一定程度后血小板CD62p的表达不受NO浓度变化的影响。过高浓度的NO供体使NO过量地释放，这可能导致由NO/cGMP途径引发的抑制信号级联反应的非生理性过度刺激从而其抑制作用有所减弱，也可能是存在除了NO/cGMP途径之外的其他对血小板有作用的途径导致其抑制血小板活化效果稳定。下一步可以从浓度、时间和检测指标上对先前的实验做出优化和补充，更深程度上研究探讨NO供体四盐酸精胺对血小板保存期质量的影响及其相关作用机制。在保证四盐酸精胺作用的安全性和有效性后，可以将其制备成一种血小板保存液添加剂，以提升存储期血小板的质量。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突