马金辉 刘 洁 李媛媛 宋彦坤 郑立双 檀迎会 郗 昕

1.河北大学附属医院内分泌科，河北保定 071000；2.河北省第六人民医院普通精神科，河北保定 071000；3.河北大学医学院，河北保定 071000；4.河北大学附属医院科研处实验中心，河北保定 071000

2 型糖尿病发病机制尚不明确，目前认为胰岛素抵抗起着主要作用[1-4]。胰岛素抵抗与葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）密切相关，GLUT4是存在于肌肉及脂肪组织中葡萄糖转运蛋白的主要亚型，是维持血糖稳定的重要因素[5-8]。胰岛素抵抗的发生发展都有氧化应激的参与，与机体内抗氧化防御体系功能紊乱和自由基的增多有关[9-12]。已有研究证实在3T3-L1 脂肪细胞中，长时间胰岛素刺激会引起GLUT4 减少，降低胰岛素反应性[13-15]。这一负面效应与其增加细胞内的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平密切相关[16-18]。氧化应激的主要特点是ROS 的产生和抗氧化酶之间的不平衡。任何原因破坏了这一平衡系统，就会启动氧化应激的损伤机制[19]。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）是人体内一种重要的过氧化物分解酶，与2 型糖尿病氧化应激密切相关[20-23]。基于此，我们推测在3T3-L1 脂肪细胞中，胰岛素对GLUT4 的负性调控可能不仅是促进ROS 产生，抗氧化酶系也可能发挥了一定作用。本研究通过检测胰岛素对GSH-Px 表达的影响及GSHPx 抑制剂Mercaptosuccinate（MS）对GLUT4 表达的影响探讨GSH-Px 在胰岛素负性调控GLUT4 过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

3T3-L1 小鼠前脂肪细胞株（CL-173）购于美国标准生物品收藏中心（ATCC）；DMEM 高糖（货号：C1199 5500BT）、低糖（货号：C11885500BT）培养基购于美国Gibco 公司；胰蛋白酶-EDTA 消化液（货号：T1300）、胰岛素（货号：I8040）购于北京索莱宝科技有限公司；地塞米松（货号：HY-14648）购于MedChemExpress 公司；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）（货号：15879-100MG）、脂质（油红O）染色试剂盒（货号：MAK194）购于Sigma 公司；mercaptosuccinate（货号：M0064）购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；TRIzol（货号：RK145）、TIANScript RT Kit（货号：KR104）、Super-Real PreMix Plus（货号：FP205）购于天根生化科技（北京）有限公司；GLUT4 抗体（货号：ab654）购于艾博抗公司；α-tubulin 抗体（货号：66031-1-Ig）、羊抗鼠（货号：SA00001-1）、羊抗兔（货号：SA00001-2）二抗购于Proteintech 公司。

1.2 3T3-L1 细胞培养及诱导

3T3-L1 前脂肪细胞用含10%小牛血清的高糖DMEM 培养基，在37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。按照文献[24]报道的鸡尾酒法将其分化为脂肪细胞。

1.3 油红O 染色

3T3-L1 前脂肪细胞及诱导分化后第5、8 天，按试剂盒说明书进行油红O 染色，倒置显微镜下观察脂滴。

1.4 总RNA 提取及荧光定量PCR

3T3-L1 前脂肪细胞接种于6 孔板，诱导分化成熟后用500 nmol/L 胰岛素刺激1 h，用TRIzol 法提取细胞总RNA。用TIANScript RT Kit 合成cDNA，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。用SuperReal PreMix Plus 试剂盒进行PCR 扩增反应。反应总体积25 μl：cDNA 5 μl、引物1.5 μl、2×SuperReal PreMix Plus 12.5 μl、50×ROX Reference Dye 0.5 μl、RNase-free ddH2O 5.5 μl。用ABI 7300 型荧光定量PCR 仪进行扩增。循环条件为：95℃预变性15 min，95℃变性10 s，60℃退火/延伸32 s，共40 个循环。以β-actin 作为内参基因。采用2－ΔΔCt法计算基因表达相对含量。GSH-Px1 正向引物：5’-GTTTGAGAAGTGCGAAGTGAAT-3’，反向引 物：5’-CGGAGACCAAATGATGTACTTG-3’（产物长度：130 bp）；GSH-Px4 正向引物：5’-GATAAGAACGGCTGCGTGGTG-3’，反向引物：5’-AGATAGCACGGCAGGTCCTTC-3’（产物长度：80 bp）；GSH-Px7 正向引物：5’-CAGGACTTCTACGACTTCAAGG-3’，反向引物：5’-A-AGCACATTAAAATGATGGGGG-3’（产物长度：180 bp）；β-actin 正向引物：5’-CTACCTCATGAAGATCCTGACC-3’，反向引物：5’-CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC-3’（产物长度：90 bp）。

1.5 SDS-PAGE 电泳及Western blot 检测

3T3-L1 脂肪细胞分别用10 或20 mmol/L 的MS处理4 h 后加入或不加500 nmol/L 胰岛素刺激4 h，RIPA 裂解液提取各组细胞总蛋白，Bradford 法测定各组细胞蛋白浓度，用10% SDS-PAGE 分离，转移至PVDF 膜（120 mA，3 h）。用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入相应一抗4℃孵育过夜。TBS-T 漂洗（5 min，6 次）后加入相应HRP 标记的二抗，室温孵育1 h，TBS-T漂洗（5 min，6 次），ECL 发光显影。应用Image J 软件分析蛋白条带灰度值计算相对表达水平。

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 5 软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3T3-L1 前脂肪细胞分化及鉴定

3T3-L1 前脂肪细胞呈长梭形（图1A）；诱导分化后第5 天可见细胞逐渐变为球型，胞内可见细小脂滴（图1B）；诱导分化后第8 天可见细胞进一步变为球形且胞内脂滴明显增多（图1C）。

图1 3T3-L1 前脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞（油红O 染色，100×）

2.2 胰岛素对GSH-Px mRNA 相对表达量的影响

胰岛素组GSH-Px1、GSH-Px4、GSH-Px7 mRNA相对表达量比对照组低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2。

图2 胰岛素对GSH-Px mRNA 相对表达量的影响

2.3 MS 对GLUT4 蛋白表达的影响

2.3.1 胰岛素不存在的条件下，MS 对GLUT4 蛋白表达的影响 胰岛素不存在的条件下，10 mmol/L MS 处理组与MS 未处理组GLUT4 蛋白表达比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；20 mmol/L 处理组GLUT4 蛋白表达较MS 未处理组低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3。

图3 胰岛素不存在的条件下MS 对GLUT4 蛋白表达的影响

2.3.2 胰岛素存在的条件下，MS 对GLUT4 蛋白表达的影响 胰岛素存在的条件下，10 mmol/L MS 处理组与MS 未处理组GLUT4 蛋白表达比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；20 mmol/L 处理组GLUT4 蛋白表达较MS 未处理组低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图4。

图4 胰岛素存在的条件下MS 对GLUT4 蛋白表达的影响

3 讨论

GLUT4 是存在于肌肉及脂肪组织中葡萄糖转运蛋白的主要亚型，在基础状态时GLUT4 主要位于细胞内的GLUT4 贮存囊泡（GLUT4 storage vesicles，GSVs）及反式高尔基网等细胞区隔中[7]。进餐后血糖升高促进胰岛素分泌，胰岛素促使GSVs 在胞吐作用下转位至细胞外膜，将葡萄糖转运至细胞内。已有研究证实，长时间的胰岛素刺激会引起GLUT4 呈剂量依赖性减少且主要是对胰岛素应答的GSVs 减少，而使葡萄糖转运系统对胰岛素反应性降低[13-15]。有研究表明，在3T3-L1 脂肪细胞中添加胰岛素后GLUT4 的半衰期由原来无胰岛素状态时的50 h 降至15.5 h[14]，并且溶酶体抑制剂的添加有效阻止了这一过程[25]。长时间胰岛素刺激对GLUT4 的负性调控主要是因为其促进GLUT4 分选至溶酶体途径降解，并且此过程与胰岛素引起ROS 产生关系密切[16]。有研究报道NADPH氧化酶4 可促进胰岛素刺激的脂肪细胞产生ROS[18]。本研究结果显示，胰岛素刺激下调了GSH-Px 的转录水平，提示胰岛素刺激对抗氧化防御酶系的抑制作用。MS 可与胰岛素同样减少GLUT4 表达，提示抗氧化防御酶系GSH-Px 的活性可影响GLUT4 蛋白的表达。胰岛素不仅可通过NADPH 氧化酶4 等促进ROS 产生也可通过下调GSH-Px 家族的表达来影响细胞内ROS 的水平而负性调控GLUT4。为进一步研究胰岛素促进ROS 的产生负性调控GLUT4 提供了线索。由于有限的经费及实验时间，本研究还未检测长时间胰岛素刺激对GSH-Pxs 蛋白表达及活性的影响，以及其他抗氧化酶系如catalase 等是否也参与了这一过程也有待进一步研究证实。