粟艳婷，张 健，王少茹，宋晓秋，李婷婷

（上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 200418）

水杨酸（SA）是一种脂溶性有机酸，广泛存在于植物内源的小分子酚类化合物，20 世纪70 年代水杨酸开始用于蔬果保鲜[1]。试验表明，使用一定浓度的SA 溶液对辣椒、油桃和番茄农作物进行涂抹或浸泡保鲜处理，可以延长蔬果在室温下的贮藏时间，起到保鲜的作用[2-4]。此外，SA 是生物膜稳定剂，可延缓动物衰老，医学上用于治疗或预防解热镇痛、风湿性关节炎等疾病，有着广泛的应用空间[5-6]。Pushpa K 等人[7]使用1.0 mmol/L SA 与2%壳聚糖联合处理采后荔枝果实可以有效抑制果皮褐变，提高荔枝果实的保藏品质。付云云等人[8]研究表明，15 mmol/L SA 溶液处理仔姜保鲜效果较好，能够有效防止其腐败，延长货架期。已有的一些果实保鲜研究表明SA作用与抑制酪氨酸酶的活性有关。李晓莺等人[9]用SA溶液处理枸杞鲜果后，其多酚氧化酶活性明显降低。Dan Z 等人[10]报道SA 质量浓度高于0.3 g/L 时可显著抑制酪氨酸酶活性，其抑制机制为SA 与酪氨酸酶结合使其失活，进而达到抑制果蔬褐变。果实在贮藏过程中发生褐变的内部因素主要是由于体内的酚类物质发生酶促氧化反应，果实内的酚物质含量、多酚氧化酶的活性和氧气的供应是果实产生褐变的三大基本条件[11]。酪氨酸酶也称多酚氧化酶（PPO），多酚氧化酶是一种重要的末端氧化酶，在热带水果的保鲜、贮运及加工过程中，该酶是引起果蔬酶促褐变的主要酶类，严重影响了制品的营养、风味及外观品质[12]。因此，通过对酪氨酸酶的测定能从这一指标上考查物质对褐变性能促进或抑制。如果多酚氧化酶的活性降低，可以间接地抑制果实发生褐变，保持果实的商品价值。

水杨酸虽然在蔬果保鲜上有应用前景，但由于水杨酸的酸性强、溶解性小和刺激性味道较大，而且使用浓度越大刺激性味道越重，直接将水杨酸溶液用于果实保鲜一是无法做到均匀溶解，二是会残留刺激性味道，使用难度大。也有研究报道将水杨酸进行酰化形成乙酰水杨酸，乙酰水杨酸无臭，微溶于水，乙酰水杨酸在组织内易发生水解转化为SA发挥保鲜作用[13-14]。但是，乙酰水杨酸需要先经过化学反应合成，成本较高。针对SA 水溶性差，导致药性不理想，并且异味、刺激性太强这些问题，将SA制备成微胶囊以增加其水溶性和减小其刺激性味道，提高SA 的使用效率和增大其使用范围。微胶囊是利用天然的或合成的高分子成膜材料（壁材）将气体、液体或固体的微小颗粒（芯材）包裹在具有半透性或密封囊膜里，包合物对囊内的活性成分具有保护、稳定、传递及缓释等作用[15-16]。目的是将SA 和壁材制成微胶囊后，提高其溶解度、稳定性，微胶囊的缓释特性也可以延长药效，同时降低水杨酸的刺激性，掩盖其气味[17-18]。在制备得到水杨酸微胶囊（SAM）的基础上研究SA 及SAM溶液抑制酪氨酸酶活性的效果，并以探讨SA 及其微胶囊对抑制褐化的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-酪氨酸（Purity≥99%），Ruibio 公司提供；酪氨酸酶（25 kU，纯度为99.9%），Worthington Biochemical 公司提供；磷酸氢二钠（分析纯）、磷酸二氢钠（分析纯）、水杨酸（SA，分析纯），国药集团化学试剂有限公司提供；乙腈（HPLC 级，≥99.9%）、甲醇（HPLC 级，≥99.9%），Adamas-beta公司提供；甲酸（色谱纯），Spring&Autumn 公司提供。香蕉品种为芝麻蕉（Musa sapientum fixa sesamae）；初始品质指标，购自上海华联超市；要求无病虫害、大小均匀、八成熟，数量为8 组。

1.2 仪器设备

Agilent LC 1260 型高效液相色谱仪，Agilent Technologies 公司产品；HH-2 型数显恒温水浴锅，邦西仪器科技（上海）有限公司产品；PHS-3C 型数显酸度计，上海越平有限公司产品；AL104 型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；1620QT 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；TECAN Infinite M200PRO 型多功能酶标仪，奥地利帝肯有限公司产品；NH310 型高品质电脑色差仪，深圳市三恩驰科技有限公司产品；移液枪（20～200 μL，100～1 000 μL），多道移液枪（1～10 μL），上海泰坦化学有限公司产品。

2 试验方法

2.1 水杨酸微胶囊（SAM）制备

根据专利文献[19]的方法制备SAM，称取2.0 g SA 和0.2 g 质量分数为10%的磷酸钠溶液，加入5 倍丙二醇将SA 溶解均匀，称取司盘-80 和吐温-80 各0.1 g，加入到上一步溶解均匀后所得的SA 溶液中，在高剪切分散乳化机的作用下以转速15 000 r/min 均质乳化数分钟。称取β -环糊精6.0 g 溶于去离子水中制成质量分数为45%的β -环糊精水溶液，然后加入1 g 羧甲基纤维素钠溶解均匀制作壁材；将上述步骤所得的SA 乳化液加入到壁材溶液中反应2 h，反应温度为45 ℃，搅拌速度500 r/min，反应结束后冷却至室温后静置，经过滤、洗涤、干燥，得到装载SA 的复合壁材微胶囊。

2.2 SA 含量的测定

根据文献[20]，使用改进的条件测试SA 含量，通过方法考查后SA 的测定及其标准曲线制作采用以下色谱条件：色谱柱4.6 mm×150 mm 色谱柱，吸收波长300 nm，柱温35 ℃，流动相0～2 min 时，30%乙腈：70% 水（含0.1%甲酸）；12 min 时，80%乙腈：20%水（含0.1%甲酸），流速1 mL/min；时间20 min，进样量5.00 μL。

2.3 SA 包埋率的测定

精准称取SAM 3.0 mg，先加入少量甲醇，然后用超声的方法（时间10 min，功率50 W）进行处理，使SAM充分溶解破壁释放出SA，最后用甲醇定容于10 mL 容量瓶中。通过与制作的水杨酸标准曲线及标准品的对比，确定水杨酸微胶囊中水杨酸含量及包埋率。

包埋率计算见公式（1）：

2.4 酪氨酸酶抑制率的测定

用移液枪分别在EP 管中加入L-酪氨酸溶液500 μL 和PBS 缓冲液（pH=6.8）1 000 μL，再依次分别加入不同浓度2 000，1 000，500，250，125，62.5，31.2，15.6，7.82 nmol/L 的SA 或SAM 溶液100 μL，混合后，用移液枪分别取混合液150 μL 置于96 孔板内，标注为样品溶液C。待放入酶标仪时，再用多道移液枪快速加入10 μL 酪氨酸酶溶液。在96 孔板的空白处加入3 种对照溶液，对照溶液A 为L-酪氨酸溶液500 μL 和PBS 缓冲液1 000 μL，加入去离子水100 μL，混合。取对照溶液A 150 μL 置于96 孔板内，待放入酶标仪时再加入酪氨酸酶溶液10 μL。对照溶液B 为L-酪氨酸溶液500 μL 和PBS缓冲液1 000 μL，加入去离子水100 μL，混合。取对照溶液B 150 μL置于96 孔板内，待放入酶标仪时，不再加入酪氨酸酶溶液。对照溶液D 为L-酪氨酸溶液500 μL 和PBS 缓冲液1 000 μL，加入不同浓度的SA（或SAM）溶液100 μL，混合。取对照溶液D150 μL置于96 孔板内，待放入酶标仪时，不再加入酪氨酸酶溶液。根据文献[21]，使用酶标仪于波长475 nm 处测定吸光度，每个样品做3 个平行测定，前30 min，每隔4 min 测定1 次；后30 min，每隔15 min 测定1 次，共测定1 h。

酪氨酸酶抑制率计算见公式（2）：

式中：ODA——对照溶液A 吸光度；

ODB——对照溶液B 吸光度；

ODC——样品溶液C 吸光度；

ODD——对照溶液D 吸光度。

2.5 色度测定

采用模拟加速试验，使用鲜切香蕉，产品实际应用时为带果皮使用。选取同一批次大小均一、无病虫害的新鲜香蕉，观察不同药物及浓度对果实外观的影响，香蕉切成6 mm 厚片，每个样品做6 个平行组，分别用不同质量浓度（0.5 g/L 和1.0 g/L）的SA 水溶液、（0.5 g/L 和1.0 g/L）SAM水溶液、1.0 g/L β-环糊精（β-CD）浸泡5 min，以水（CK）浸泡作为对照，捞出后自然晾干，置于室温（25±2 ℃）贮藏。根据文献[22]，运用色差仪测其L*值（即亮度）的变化，以此比较褐变的程度及使用效果。

2.6 数据分析

采用Origin 9.0（2018）软件绘图，统计方法使用Spss（22.0）软件，采用数据=平均值±SE（n=3）。

3 结果与分析

3.1 微胶囊中SA 含量及包埋率

根据2.2 方法对SAM中所包埋的SA 含量进行测定。根据SA 质量浓度和峰面积对应关系得到的回归方程为Y=7 427X+514.07（R2=0.996 8），SA 在10～2 500 μg/mL 范围内呈良好的线性关系。

SA 标准品液相色谱图见图1，SAM 液相色谱图见图2。

图1 SA 标准品液相色谱图

图2 SAM 液相色谱图

检测扫描得到SA 最大吸收波长为300 nm，选择在此波长下的色谱峰面积定量，在该色谱条件下SA 的保留值为5.3 min。将SAM 样品配成质量浓度为3 mg/mL 的溶液进行液相测试，带入回归方程计算结果SAM 样品中含有0.75 mg/mL 的SA，由此计算得到SAM的包埋率为25.0%。

3.2 SA 及SAM对酪氨酸酶活性的抑制作用

酪氨酸酶普遍存在于生物体中，是多功能铜结合氧化酶，可以作为酪氨酸羟化酶、多巴氧化酶，是产生黑色素的决定性酶，也是引起蔬果褐变的关键酶[23]。酪氨酸酶具有双重催化作用，首先羟化酪氨酸生成多巴，多巴进一步氧化得多巴醌和多巴色素，进而形成一系列引起褐化的色素类物质[24-25]。在连锁氧化反应过程中抑制酪氨酸酶活性并使其失活，即可有效制止氧化反应的发生，延缓果实发生褐变。通过研究SA 和SAM 对酪氨酸酶的抑制率，可以考查两者防止褐变的效果。

SA 及SAM溶液对酪氨酸酶的抑制作用与浓度的关系见图3。

图3 SA 及SAM 溶液对酪氨酸酶的抑制作用与浓度的关系

溶液浓度指SA 浓度或SAM包埋的SA 在溶液中的实际浓度。由图3 可知，SA 及SAM对酪氨酸酶的影响存在较明显的量效作用，SAM 中的SA 浓度为250 nmol/L 时，显示对酪氨酸酶抑制效果最强，抑制率最高达到69%，显著大于同一浓度下SA 对酪氨酸酶的抑制率43%（p＜0.05)。如果采用抑制率达到50%的浓度（IC50）作为评价抑制能力强弱的指标，在试验中显示出SAM 的IC50为31.2 nmol/L，而SA的IC50为125 nmol/L，SAM的抑制能力比SA 提高了4 倍。结果表明，SA 经过微胶囊化后，其对酪氨酸酶作用的敏感度提高了，在一定程度上，较少的SA用量对酪氨酸酶就能起到同样的抑制作用，不仅减小SA 带来的刺激性味道，而且还提高了SA 的利用度。在测试的浓度范围内，SA 对酪氨酸酶的抑制率随SA 浓度的增大而逐渐增大，于250 nmol/L 达到抑制的最高值，随后随着SA 浓度的增大，抑制率逐渐减小，可能是由于酪氨酸酶反应完全或SA 浓度已达到了作用的饱和状态，导致抑制率的下降。

SA 及SAM 对酪氨酸酶的抑制作用随时间变化的曲线（CSA 为31.2 nmol/L）见图4。

图4 SA 及SAM 对酪氨酸酶的抑制作用随时间变化的曲线（CSA 为31.2 nmol/L）

图4 为在31.2 nmol/L 浓度下SAM 和SA 溶液对酪氨酸酶的作用随时间变化的曲线，图4 中0 点为加入样品试剂后开始读数的记录点，SAM与SA 对酪氨酸酶抑制率随时间的增加而减少，在反应的前30 min里下降幅度较快，抑制率减少至10%，说明SAM和SA 与酪氨酸酶反应在约30 min 短时间内反应速率最大，然而试验数据显示SAM对酪氨酸酶的抑制率始终高于SA，反映出SAM对酪氨酸酶的抑制能力显著高于SA。以β -环糊精为壁材包合SA 制备成微胶囊后提高了药物的溶解性和稳定性，防止药物氧化与分解，使其充分地发挥其抑制酶活性的作用，从而使其抑制酶活性的能力更高。β -环状糊精是食品级原料，常用于食品制造，在此作为微胶囊主要壁材包埋SA，还达到消除异味的效果，解决了SA 的刺激性大的问题[26]。

3.3 SAM与SA 对色泽变化的影响

酪氨酸酶在细菌和植物体内均为可溶性的，在植物体内形成黑色素的唯一途径是通过酪氨酸酶控制L-多巴转化为L-多巴醌，多巴醌再经过一系列的反应最终形成黑色素[27]。因此，可以以色泽变化评价样品对酪氨酸酶的影响。使用色差仪测试用SAM和SA 浸泡后的香蕉色度，于室温（25±2 ℃）在0 h 及放置24，48 h 时测定香蕉的色度。

贮藏过程中香蕉色度随时间的变化见图5。

图5 贮藏过程中香蕉色度随时间的变化

色泽是食品质量的一个重要特性，L*表示亮度，亮度减小，褐变加重。香蕉的果实容易因为酶促褐变反应而导致香蕉的褐变及腐烂[28-29]。PPO 活性升高引发酶促褐变反应，表现果皮变色，造成营养丢失及经济损失[30]。由图5 可知，在贮藏期用不同浓度的不同样品组浸泡香蕉，每组初始浸泡时的亮度值无区别，浸泡后保存24 h 测试，所有组别溶液的亮度值与0 h 相比有明显下降，下降值约为15%，24 h时香蕉已发生褐变，浸泡24 h 后只有1.0 g/L SAM组保持高的亮度值，说明香蕉褐变较小。结果表明除了SAM高剂量组以外的所有组别溶液均未显示出有效抑制酶促褐变的作用。Orang K 等人[31]研究在5 ℃冷藏条件下用SA 溶液处理香蕉能够明显抑制多酚氧化酶活性来减缓果实发生褐变。试验中浸泡后于常温保存48 h 后，除1.0 g/L SAM 组以外的其他组亮度值都显著降低，结果表明经1.0 g/L SAM组作用的亮度值虽然随时间增长而减小，但该组的亮度值下降最低，24 h 和48 h 该组的亮度值明显高于SA组、低剂量SAM组及壁材组等其他对照组，48 h 时其亮度值为55%，高于其他组至10%～15%，表明1.0g/L 的SAM溶液能够有效抑制褐变发生。

SA 的低溶解性可能是其抑制褐变效果不明显的一个主要原因，通过微胶囊化使SA 在水溶液中分散性增强，增大SA 与物体表面的实际接触面积，同时通过缓慢释放抑制酶活性。推测是微胶囊化后的SAM 在溶液中均匀分散，在果实表面形成一层保护膜，隔离空气的接触，防止发生氧化反应，减小褐变发生。低浓度的SAM不能有效抑制酪氨酸酶活性的原因可能是果实中存在一些酚类物质与SA 形成氢键作用，从而影响SA 与酪氨酸酶活性位点的结合，随着SA 浓度的增加，SA 抑制酶活性逐渐占主导地位就能够有效地抑制褐变[32]。酸化作用、与酶的结合作用是SA 抑制多酚氧化酶和控制酶促褐变的主要作用机制，SA 对PPO 是竞争性抑制作用，酸性pH 值增强了SA 与PPO 的结合，降低了结合能，增加了氢键和静电相互作用[33]。低浓度的SAM 没有提供足够的酸性条件，与PPO 的结合能力低，可能与其未显示出抑制褐变的作用相关。将SA 微胶囊化后显示出有效延缓酶促反应速率的结果，SAM 抑制褐变作用呈剂量依赖性，进一步增加微胶囊中SA 的浓度可能会更好地发挥其抑制褐变作用。SAM 能够显著提高SA 在溶液中的分散性和稳定性使其抑制褐变效果更好，使果蔬保鲜更持久。

4 结论

探讨了SA、SAM对酪氨酸酶的抑制效果，并以其对香蕉的褐变抑制效应作为辅助验证。结果表明，SAM溶液在31.2 nmol/L 浓度下能够有效抑制酪氨酸酶活性和抑制酶促褐变反应的发生，其效果显著高于SA 溶液。试验中，SAM 溶液在31.2 nmol/L 浓度能够有效抑制酪氨酸酶活性，并于250 nmol/L 达到抑制的最大值，使用1.0 g/L SAM可在常温条件下就能够有效抑制香蕉发生褐变。一个验证基础理论的初步试验，应用到果蔬全储运期的保鲜需要今后进一步的研究。总之，SAM 溶液对易因酪氨酸酶引起作用是抑制效果良好的，且制备SAM 成本低，在果蔬贮藏保鲜中有潜在的应用价值，SAM 将可能是具有市场潜力的酪氨酸酶抑制剂和食品保鲜剂。