吴惠娟 唐恒坤 杨敏仪 陈 睿 高烨宏 王荣智 汪世华

(1.生物农药与化学生物学教育部重点实验室；2.福建农林大学生命科学学院,福建 福州 350002)

1 概述

由于生态环境的变化和人类经济活动的发展，全球范围内已记录到的有害藻华(HABs)不断增加。海洋中引起赤潮的藻类多达3000多种，赤潮的发生危害生态系统和渔业经济，其特点是浮游植物快速增殖并产生大量代谢物质，引起海水颜色的改变。目前，其形成机制尚不清楚，已有多项研究表明，水温上升和过量养分是导致藻类大量生长的主要触发因素[1]。

Brevetoxins (BTxs) 是一类亲脂性环状聚醚神经毒素，属于一类神经性贝毒 (NSP)，目前发现了约70种衍生物。这类毒素在贝类中积累，主要以BTx-1 (A型) 和BTx-2 (B型)两种形式存在[2]，过量摄入、皮肤接触或气溶胶吸入是最常见的中毒途径[3-4]。接触这类毒素产生的症状通常在摄入后1～24h出现，主要表现为恶心、呕吐、腹泻、呼吸道刺激、流鼻涕、鼻子和喉咙的烧灼感、支气管收缩、感觉异常、头晕、失去协调、抽筋、瘫痪等，严重者可导致昏迷，但是目前还没有可用的解毒剂[5]。已有研究表明，高浓度的毒素可能会在以浮游植物为食的其他海洋生物中积聚，并逐级传递到人类身上；也有研究检测了海水[2-3]、空气[6-7]及其他生物体中毒素含量，揭示了其对呼吸道的刺激作用。BTxs的作用机制是通过特异性结合电压门控Na+通道的第5位点，导致通道被持续激活，大量Na+流入使神经元和肌肉膜去极化[8]。吸入BTxs后的症状会在接触后几分钟到几小时 (<24h) 开始出现，持续2～3天[9]。另外，还有研究指出这类毒素可能会诱导DNA损伤和造成染色体畸变[10]。

产生此类毒素的藻类所引起的赤潮常在美国弗罗里达洲和墨西哥湾爆发，且近几年报道了许多生物因BTxs中毒的事件，例如海龟[11]、绿树蛙[12]、石蟹[13]、海豚[14]和燕鸥[15]，在欧洲其他国家和中国海岸也有检测到此类毒素。本文主要关注BTxs的研究现状、BTxs检测标准和BTxs检测方法的研究进展。

2 BTxs研究现状及热点

近几年报道了多种生物死亡、搁浅的现象，如海龟、绿树蛙、石蟹、海豚和燕鸥等均检测出BTxs。还有报道提出在赤潮泛滥的沿海地区，BTxs可能与神经系统疾病[16]和急性发作性血管性水肿[17]有关。在澳大利亚、新西兰和日本也有相似报道[18]。近几年研究主要关注各种生物体BTxs的检测和方法创新，以及在自然条件和实验室条件下成年蛤蜊在繁殖期间受BTxs的影响[19]，以及对其后代产生的影响。此外，还有少部分研究者关注BTxs分子对离子通道的相互作用研究[20-21]、毒素分子的代谢组学和其他组学的应用[22-23]。有趣的是，基于BTxs暴露于神经元的神经再生特性，相关研究对于中风的治疗具有重要意义。虽然暴露于环境中天然存在的BTxs对动物和人类具有强效炎症效应[24]，但是其为模拟中风的活动依赖性恢复[25]研究提供了理论依据。

3 BTxs检测标准

美国(东海岸、墨西哥湾)和新西兰已经制定了监管限制，可接受的BTxs水平在活的和生的双壳贝类的食品法典标准为200个小鼠单位(MU)/kg[26]，或0.8 mg BTx-2当量/kg总贝类肉[27-28]。在欧洲，目前管制四组亲脂性毒素：冈田软海绵酸、果胶毒素、yessotoxins和氮杂螺环酸[28]。2018年，在科西嘉岛(地中海)的法国贝类中首次检测到BTxs，同年，为监测新出现的毒素，如环状亚胺、卵毒素和BTxs等，法国海岸建立了一个名为EMERGTOX的监测计划。为了保护消费者的健康，我国针对发现的主要海洋毒素建立了一套海产品安全标准。目前，我国已经建立了多溴二苯甲醚的分析方法，并将其应用于双壳类、海水、浮游植物和沉积物样品中的毒素检测。

4 BTxs检测方法研究进展

到目前为止，BTxs检测的方法有小鼠生物测定(MBA)、受体结合测定、ELISA法、电化学测定和LC-MS[33-34]等。

4.1 MBA法

自2013年以来，欧盟国家对于亲脂性毒素的检测均采用MBA衡量某类物质对于生物体的毒性[9]，通过乙醚从贝类研磨物中提取毒素，并给小鼠注射，观察小鼠反应。这种测定方法在贝类养殖场和市场监测项目中应用广泛，对于进一步确认其他化学结构及功能和确定监管毒性水平是十分必要的。

4.2 受体结合测定

受体结合法基于毒素分子与离子通道的相互作用，BTxs与Na+特异结合。Mccall等[31]开发了一种基于大鼠脑突触体作为受体和BTx-2作为BTx类似物的荧光探针的竞争性结合试验。此外，Murata等[32]开发了基于大鼠脑突触体和吖啶-BTx-2的化学发光受体结合试验，检测限为1.4 amol。然而，突触体不稳定，需要在-80°C下储存，并且该测定是一个耗时的过程。小鼠神经母细胞瘤细胞毒性试验 (N2a-assay) 是一种灵敏、高通量的体外检测方法，可有效检测Na+通道特异性海洋生物毒素。Loeffler等[33]通过添加药物哇巴因和藜芦定来实现对激活Na+通道的化合物的测定。然而，添加的药物可能对N2a细胞有毒，并且它们在浓度不足或过高的情况下应用会降低该测定法对海洋毒素检测的有效性。Viallon等[34]评估了N2a-assay的6个关键参数：细胞接种密度、生长26小时后的细胞层活力、噻唑蓝孵育时间、哇巴因和藜芦苷处理以及溶剂和基质效应，确定了用于验证N2a-assay的五个可行性控制，实现了对BTx-3的特异性检测。该方法虽然灵敏度很高，但产生的结果波动相对较大且需要18～24h才能完成。Caglayan等[35]基于适配体的检测方法用于BTxs检测，该法在水溶液中的检测限分别为1.48 nM和0.80 nM。

4.3 ELISA法

ELISA法具备高特异性，能够实现快速的现场检测，在海产品进出口检测中发挥了重要作用。Ling等[36]以BTx-1为靶标，开发了具备高特异性、检测限为200 ng/mL的胶体金试纸条。近几年，研究者主要采用ELISA和LC-MS检测方法，更侧重于试剂盒的适用性评估、LC-MS的检测优化以及其他方法的优化改良。比如Cunningham等[37]通过采集血液样本评估市售最初用于定量海水和贝类组织提取物中的BTx-3的ELISA(多克隆抗体)试剂盒，表明该试剂盒可准确定量人血浆中0.0400～2.00 ng/mL的BTx-3，但对其他常见BTx类似物具有不同的交叉反应性，因此仍需要通过更有针对性的方法进行鉴定(如LC-MS)。

4.4 电化学检测

传统的ELISA法具有局限性，而电化学方法具有高灵敏度、低成本、低功耗和高度兼容的特点，适用于小型传感器和自动检测。研究者多采用在免疫检测的基础上开发，结合电化学方法放大信号的策略。Zhang等[38]在竞争性免疫测定的基础上，使用可区分的金属纳米簇标记分子，设计了一种新的超灵敏多重免疫测定方案，检测限为1.8pg/mL。这种方法与传统电化学标记相比，可以产生非常灵敏特定的信号；相对于传统的酶标方法，金属纳米团簇显得简单且通用，不仅不需要酶底物，而且减少了对分析物的污染。Zhang等[39]利用聚苯乙烯微球与二氧化硅纳米容器中的特定抗体结合，通过伏安法检测纳米容器内的亚甲蓝释放量进行快速检测，其检测限为6 pg/mL。Zhang等[40]建立了较常规方法更灵敏、抗体用量更少、更快速的基于毛细管电泳的免疫检测方法(CE-IA)，检测限为100pg/mL，是分析贝类样品中BTxs的有力工具。Tang等[41]基于竞争结合的原理，建立了一种检测限为0.6pg/mL，基于新型石英晶体微天平(QCM)的免疫传感策略。通过苯氧基官能化葡聚糖(DexP)组装到石墨烯包被的QCM探针的表面上，然后通过葡聚糖结合刀豆蛋白A(ConA)标记的小鼠单克隆抗BTx-2抗体并固定在DexP修饰的探针上，以葡萄糖淀粉酶和牛血清白蛋白-BTx-2(BTx-2-BSA)偶联物高度官能化的金纳米颗粒作为标签进行检测。Eissa等[42]通过体外选择高亲和力DNA适配体并使用荧光和电化学阻抗谱(EIS)监测BTx-2与适配体的结合，开发了一种基于心肌细胞的便携式生物传感器，可以提供一种无标记且方便的方式来实时监测心肌细胞网络的自发电活动，大大缩短了海洋毒素的检测时间。这种适配体BT10用于构建BTx-2的无标记竞争性阻抗生物传感器，检测限为106pg/mL。

4.5 质谱检测

液相色谱与串联质谱(LC-MS/MS)结合了液相色谱的分离能力、三重四极杆质谱的高灵敏度和选择性质量分析能力，具备高度的灵敏性和特异性，成为测定和定量BTxs的宝贵工具。Shin等[43]为BTx-1、BTx-2和BTx-3毒素开发了LC-MS/MS，定量限为25μg/kg。同样，Wunschel等[44]针对包含BTx的多种毒素开发了一种电喷雾LC-MS/MS系统，每种毒素的检测限为2.5 μg/kg。Dom等[45]建立了一个高分辨率LC-MS系统来检测贻贝和牡蛎中的14种毒素。然而，ELISA法或LC-MS/MS方法受到多个因素的影响，需要联合其他现代技术。液相色谱—高分辨率质谱具有高精度和高分辨率，该技术在未知化合物的发现和鉴定中发挥着重要作用。已有研究报道了一种快速、灵敏、可用于定量两种双壳贝类基质中的八种环亚胺和两种BTxs类似物的超高液相色谱—MS/MS(UHPLC-MS/MS)方法[46]。为分析环境样品、海洋生物和水中的毒素，Onofrio等[47]开发了两种方法来筛选13种毒素，使用超高效液相色谱—串联质谱检测到特定的毒素。捕集器和柱内稀释(ACD)技术的联合使用具备提高检测限、实现多种毒素组的共同检测、可注入100%有机溶剂样品、确保分析物稳定性并消除繁杂的样品制备步骤，进样体积可达1mL，从而使分析物的检测限在0.001～0.05μg/L之间的优点。液相色谱—飞行时间质谱 (LC-ToF-MS) 是一种常见的液相色谱—高分辨率质谱类型。液相色谱—串联四极杆质谱(LC-QqQ-MS/MS)灵敏度高，有利于准确检测海洋环境中低浓度的目标化合物。已有研究通过建立一种基于二者结合的改进方法[48]，用于分析K.brevis产生的细胞内和细胞外BTxs代谢物。该方法可用于快速鉴定和进一步测定在实验室培养的不同生长阶段K.brevis的BTxs代谢物的产生。LC-ToF-MS和LC-QqQ-MS/MS技术相辅相成，可以对不同环境条件样品中BTxs代谢物谱进行全面筛选和准确鉴定。

5 研究展望

如前所述，研究人员均采取ELISA法初步检测和LC-MS/MS鉴定化合物的方法评估毒素含量。MBA法能真实反映毒素分子毒性，目前仍是许多国家进行贝类产品检测的选择；N2a-assay检测基于受体特异而非毒素分子特异，因而应用受到了限制；质谱串联检测能精确鉴定毒素分子但仅限于实验室内应用；电化学传感器和ELISA方法的结合应用正在进行大量的研究。在实际应用过程中，采取先使用免疫测定法检测广泛的BTxs，然后进行色谱确认的检测策略可以加快鉴定流程，然而采用此种策略对于市场售卖的ELISA试剂盒的精确度和特异性提出了更高要求。虽然研究者提出了许多检测策略，但是目前还没有统一、高效的BTxs检测方法。

随着科学技术的发展和大量新的、对人体有害的毒素的发现，仅依赖于事先确立的毒素目标清单进行检测的策略已不适用。在我国，检测也仅限于在名录内的毒素，对于非名录毒素的检测缺乏有效的检测手段。因此，进一步构建一个对于BTxs和NSP的动态预防监测体系将有利于检测和发现新的毒素，为后期采取及时而有效的应对措施提供技术支持。