＊邢源月 王佳琦 黄红梅

（1.湖南农业大学生物科学技术学院 湖南 410000 2.长春白求恩制药有限公司 吉林 130000）

灵芝学名Ganoderma lucidum，又被称为灵芝草、灵仙草。灵芝是著名的药用真菌，两千多年来作为中草药和功能性食品在我国及其他亚洲国家被广泛使用。近几十年来，灵芝子实体中的生物活性化合物一直备受国内外学者的关注，这些与药理作用相关的活性物质包括多糖类、三萜类、甾醇类、蛋白类及肽类。国内外研究学者们已证实灵芝多糖是最主要的活性物质，灵芝多糖具有多种生理功能，包括抗氧化、抗菌、抗癌、抗衰老、消炎、保护心脏和调节免疫等。

前期研究中，以酵母菌和乳酸菌对灵芝子实体进行培养发酵，可获得具有美白功效和抗氧化活性的灵芝发酵液。据张璐等研究，控制灵芝发酵过程中的营养条件可显著提高灵芝多糖的产量、抗氧化活性和抑菌活性。灵芝深层发酵技术相较于传统农业栽培具有多种优势：缩短生产周期、提高产量及可控的产品质量。因此，基于液态深层发酵技术生产灵芝中功能活性物质已成为研究热点。

本研究以灵芝为主要材料，探究发酵时培养条件pH、温度、转速、通气比和营养条件碳源、氮源对灵芝子实体生长情况及多糖产量的影响，并通过中试实验对最佳培养条件进行验证，以期为灵芝液态发酵工业化生产提供依据。

1.材料与方法

(1)实验材料

供试菌株为多孔菌科四川灵芝。

①主要实验试剂

葡萄糖、麦芽糖、乳糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铵、硫酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、硫酸铜均为（国药集团化学试剂有限公司），分析级；葡萄糖（廊坊盛泰药业有限公司），工业级，蛋白胨（福建三和生物科技有限公司），工业级。

②主要实验仪器

HZQ-Q型全温振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；SW-CJ-2FD型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；YXQ-LS-50型立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司）；BLBIO-3GC-4 3L四联磁力搅拌发酵罐（连云港百仑生物反应器科技有限公司）；100L机械搅拌发酵罐（上海保兴生物设备工程有限公司）；1000L发酵罐（长春市液压换热设备制造厂）；BAY70/800型板框压滤机（吉林市众诚分离机械制造有限公司）ZZNG-1000真空浓缩装置（长春制药机械厂）。

③培养基配方

A.固体培养基：马铃薯200g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，琼脂24g，水1000ml。

B.液体种子培养基：葡萄糖30g，蛋白胨5g，酵母浸粉2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁1g，硫酸铵2g，水1000ml，pH值6.0。

C.发酵培养基：葡萄糖48g，蛋白胨3.6g，磷酸二氢钾0.36g，维生素B120mg，氯化钠0.6g，聚醚消泡剂0.4g，水1000ml，自然pH值。

(2)试验方法

①液体发酵培养方法

未经优化前的初始发酵条件为用C中的发酵培养基，经121℃灭菌30min，按0.75%的接种量转接二级摇瓶菌种至发酵培养基中，控制培养温度在28℃，自然pH值，搅拌转速50rmp，通气比2，中途补料一次（补料培养基同优化前的发酵培养基），培养至168h发酵结束。

用优化后的发酵培养基：葡萄糖20g，蛋白胨4g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁1g，硫酸铵2g，水1000ml，pH值6.0。经121℃灭菌30min，按5%的接种量转接二级摇瓶菌种至发酵培养基中，控制培养温度在28±2℃，pH值自然，搅拌转速150rmp，通气比2，中途补料一次（补料培养基同优化后的发酵培养基），培养至168h发酵结束。

②发酵液粗多糖的提取与测定

粗多糖提取参考张璐等的方法加以优化。板框机经滤布过滤分离菌丝体与发酵液，将发酵液真空悬蒸，用比重计判断，浓缩至密度1.30以上（1.33～1.38），浓缩的倍数约为15～20倍。总糖含量测定：取浓缩后灵芝浸膏约1g，精密称定至锥形瓶中，加入4N硫酸20ml，置于沸水浴中加热水解7min，冷却，用40%氢氧化钠液调至中性，移入200ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1ml，置锥形瓶中，加入斐林试液甲、乙各5ml，混匀，用滴定管滴加入0.1%标准葡萄糖液（不得过量），加热至沸腾，继续滴加葡萄糖液至溶液呈浅黄色，同时做空白对照；还原糖含量测定：取浓缩灵芝浸膏约1g，精密称定至200ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，以下操作同总糖测定。多糖含量=总糖含量-还原糖含量。（标准规定本品中多糖含量不得低于7%；斐林试液甲：硫酸铜15g，亚甲基蓝0.05g，溶于1000ml；斐林试液乙：酒石酸钾钠50g，氢氧化钠54g，亚铁氰化钾4g，溶于1000ml）。

2.数据分析

数据采用数据分析软件SPSS（PASW Statistics 18）进行统计分析采用进行单因素方差分析，通过Ducan方差分析事后检验判断差异显著性（P＜0.05）。基于单因素试验结果设计3因素正交试验。

3.结果与讨论

(1)灵芝液体深层发酵优化

①灵芝液体深层发酵培养条件优化

由图1可知不同发酵pH、温度转速和通气比对多糖产量和菌丝干重具有显著影响。弱酸性环境pH=6.0时发酵效果最佳，多糖含量达8.03±0.11%，菌丝干重为14.33±0.15g/100mL，pH高于或低于6.0值多糖含量和菌丝干重菌菌降低，尤其在碱性条件下（pH=8.0），菌丝干重和多糖含量迅速降低。如图1(B)所示，灵芝发酵最适温度为28℃，多糖产量最高，为（8.73±0.11%），在20～25℃时和30～32℃时，菌丝干重分别降低19.43%～32.03%和43.49%～61.43%，高温对灵芝发酵产多糖影响较大，在发酵过程中应严格控制发酵罐温度，尤其避免温度过高导致产量降低。搅拌转速和通气比影响发酵液中氧气含量和分布，如图1(C)(D)所示，不同转速和通气比对灵芝产多糖含量有影响，但与pH和温度条件相比影响效果较低。搅拌速度低于150rpm时，底物与氧气接触不充分，菌丝形成较少，而过高转速（200rpm）同样给菌丝形成带来负面影响，选择150rpm既能保证氧气均匀分布又不引起剧烈晃动，适于菌丝形成图1(C)；如图1(D)所示，通气量越高越利于菌丝发酵，当通气比为1:2时，菌丝干重13.97±0.11g/100mL，多糖含量高达7.47±0.06%。

图1 不同初始pH、发酵温度、搅拌转速及通气比条件下对灵芝发酵液多糖含量和菌丝干重的影响

②灵芝液体深层发酵营养条件优化

由图2(A)可知，不同碳源对灵芝发酵液产多糖量影响有一定差异，但多糖含量在6.16%～7.87%，差异较小。以麦芽糖为碳源的发酵液胞外多糖产量最大，其次为赤砂糖和葡萄糖。虽然以葡萄糖作为培养基所产灵芝多糖略低于赤砂糖和麦芽糖，由于葡萄糖具有价格低、成分简单，可被微生物快速利用有利于提高发酵效率，因此，选择葡萄糖作为发酵液的碳源。如图2(B)所示，不同氮源决定灵芝多糖产量，其中，以牛肉膏为氮源的发酵液胞外多糖产量最高，其次为蛋白胨，考综合经济方面考量，选用蛋白胨为发酵液氮源。如图2(C)(D)所示，探究不同浓度的葡萄糖浓度和蛋白胨浓度对多糖含量影响，结果显示，2%～10%浓度的葡萄糖，浓度越高发酵液多糖产量越低；蛋白胨浓度在0.4%时多糖产量最高，高于或低于此浓度，多糖产量均减少。③转种时间优化

图2 碳源、氮源、葡萄糖浓度和蛋白胨浓度对灵芝液态发酵液的影响

在产业化应用前，需先将灵芝菌在摇瓶内生长壮大后才能进行后续的中试放大，所以对于灵芝菌在摇瓶内的定植时间进行了优化，结果如下表1和图3所示。从生长曲线可以直观看出，若种子摇瓶按10%接种量，在18～48h内，菌体干重增长迅速，说明细胞快速增殖，是灵芝菌的对数生长阶段，即此阶段的灵芝菌生长最旺盛，菌丝活力最强，故24～36h为最佳转种时机；在48～72h，菌体干重几乎保持不变，说明细胞的生长代谢平衡，不再增长，此阶段是灵芝菌菌生长的平稳期，此时用嗅觉可闻到摇瓶开始产生酸味儿，图中显示pH值从初始状态的5.12下降至3.75，这与48h后能闻到酸味儿现象一致；在72h之后，菌体干重有所下降，说明细胞的生长代谢减慢，这时候灵芝菌进入衰亡期，此阶段表现为灵芝菌丝细胞空心化，细胞会逐步降解，菌体干重下降，并释放细胞内碱性物质使其pH略有升高。综上说述，灵芝菌经过摇瓶培养选取24～36h为最佳转种时机，将灵芝菌接种至发酵罐中继续培养。

表1 灵芝菌摇瓶定植时间优化

图3 灵芝菌摇瓶生长曲线

④正交试验优化灵芝液体深层发酵

由①和②单因素实验结果确定培养条件和各成分之间对灵芝产胞外多糖产量较大影响的是pH6.0、2.0%葡萄糖、0.4%蛋白胨。根据正交试验设计原理，以这三个因素为自变量，以获得较高灵芝浸膏多糖产量，9个试验点给出的结果见表2所示。从表中可见，对灵芝浸膏多糖含量的影响因素重要性依次为：葡萄糖浓度(A)＞pH值(C)＞蛋白胨浓度(B)，灵芝浸膏多糖含量随菌丝干重增大而增加。当培养基组成为A1B2C2中葡萄糖添加量为2%，蛋白胨添加量为0.4%，pH为6.0时，多糖含量为11.2%，菌丝干重16.5g，此时多糖含量最高，因此A1B2C2组合为最优条件组合。

表2 正交试验设计及结果

(2)中试生产验证深层培养灵芝菌的发酵工艺条件

中试生产是小试与工业化应用的必经之路，也是研究结果转化的重要桥梁。中试目的是为达到小试的成果及各项指标，验证小试提供的加工条件与原料等方面是否适合工业化生产。根据3.1小试筛选出的最佳生产条件，进行了三次独立重复的中试实验，实验条件及结果见表3。三次中试结果显示灵芝浸膏中多糖含量在10.1%～11.6%之间，菌丝干重为13.6～15.5g/100mL，该结果与小试产品无显著性差异，验证了工业化生产的可行性，可直接运用于工业化生产。

表3 中试生产试验条件及结果

4.结论

通过单因素实验确定了培养条件及营养条件，再经过3因素优化得到灵芝深层发酵产多糖的最佳条件为温度28℃，pH值6.0，转速150rpm，通气比为2，葡萄糖含量2%，蛋白胨含量0.4%，培养时间168h。该实验结果经过1t的中试实验得以验证，未经优化培养条件发酵浸膏多糖含量为3.6%～4.2%，优化后的多糖得率可达10.1%～10.6%，较未经优化培养条件的发酵多糖得率提高6%。