王会会 程启东 戴梦 赵建强 任风芝 葛鹍鹏 张志江

摘 要：为了提高东方拟无枝酸菌产万古霉素的发酵单位，降低生产成本，采用紫外诱变、常压室温等离子体诱变对东方拟无枝酸菌出发菌株V19-02进行诱变处理，通过筛选链霉素抗性突变菌株，选育高产菌株;通过对发酵培养基中碳源和氮源进行筛选，选取葡萄糖、淀粉、低温豆粉、酵母粉4个因素进行均匀设计。结果表明，获得的高产菌株V19-1-07摇瓶发酵单位提高33.7%，且具有良好的传代稳定性;优化后的培养基配比质量分数为葡萄糖8.0%、淀粉1.0%、低温豆粉1.0%、酵母粉4.0%、氯化钠1.0%、磷酸二氢钾0.1%;小试结果证明，优化配方可使50 L罐发酵单位平均达到14 110 μg/mL，比原始配方提高了28.9%。因此，研究获得的高产菌株V19-1-07可应用于万古霉素工业化发酵生产，以帮助企业降低成本，进一步提高竞争力。

关键词：发酵工程;万古霉素;复合诱变;菌种选育;均匀设计;东方拟无枝酸菌

中图分类号：TQ465.9   文献标识码：A

DOI： 10.7535/hbgykj.2022yx03011

Breeding of high vancomycin producing strains and optimization of fermentation formula

WANG Huihui1，2，3，CHENG Qidong4，DAI Meng1，2，3，ZHAO Jianqiang4，REN Fengzhi1，2，3，

GE Kunpeng1，2，3，ZHANG Zhijiang4

（1.New Drug Research & Development Company，NCPC，Shijiazhuang，Hebei 052165，China;2.National Engineering Research Center of Microbial Medicine，Shijiazhuang，Hebei 052165，China;3.Hebei Industry Microbial Metabolic Engineering & Technology Research Center，Shijiazhuang，Hebei 052165，China;4.Huasheng Company，NCPC，Shijiazhuang，Hebei 052165，China）

Abstract：In order to increase the yield of vancomycin by Amycolatopsis orientalis and reduce the cost，the original strain Amycolatopsis orientalis V19-02 was treated by UV and atmospheric and room temperature plasmas（ARTP）.High yield strains were selected by screening streptomycin resistance treatment.Meanwhile，the carbon sources and nitrogen sources of fermentation medium were optimized and four factors including glucose，starch，low-temperature soybean powder and yeast powder were selected for uniform design experiment.The results show that the yield of vancomycin fermentation of the high-yield mutant strain Amycolatopsis orientalis V19-1-07 is increased by 33.7% in flask culture.In addition，the strain has an excellent propagating stability.The optimal fermentation medium is as follows：glucose 8.0%，starch 1.0%，low-temperature soybean powder 1.0%，yeast powder 4.0%，NaCl 1.0%，KH2PO4 0.1%.The experimental results show that the production of vancomycin reachs 14 110 μg/mL under the optimal conditions by the strain V19-1-07 in 50 L fermentor，which is 28.9% higher than the original formula.After applied to large-scale production，it is conductive to reduce the cost and improve the competitiveness of enterprises further.

Keywords：

fermentation engineering;vancomycin;complex mutagensis;strain breeding;uniform design;Amycolatopsis orientalis

萬古霉素（vancomycin）由东方拟无枝酸菌发酵所得，其通过抑制细菌的生长和繁殖来杀死细菌[1]，是临床上用于治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的严重感染疾病的重要药物[2]。万古霉素的应用日渐增多，在巨大的市场前景下，提高发酵单位、降低生产成本，有利于企业在竞争中占据有利地位[3-4]。

中国生产万古霉素的厂家（如浙江新昌制药、浙江海正药业、重庆大新药业及华北制药等）都在致力于提高发酵单位的研究。江苏海阔生物医药有限公司[5]采用核糖体诱变选育方法获得的万古霉素生产菌株发酵液产量（质量浓度，下同）高达8.9 g/L，且菌株传代稳定，连续传代5次后万古霉素产量稳定性高达92.7%;北大方正集团有限公司等[6]通过在发酵过程中每天补加0.1%～0.5%（质量分数）的硫酸铵，万古霉素含量（质量浓度，下同）提高到9 500 μg/mL以上，最高可达到10 157 μg/mL。常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）具有操作简单、突变率高、获得的突变株稳定性好，已在诸多领域应用并取得成效[7]。关亚鹏等[8]应用ARTP诱变选育非达霉素高产菌株，摇瓶发酵能力比出发菌株提高了42.9%。

本研究采用一系列诱变筛选措施对万古霉素产生的菌株东方拟无枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02进行选育，旨在获得万古霉素高产菌株，并且通过优化发酵培养基，进一步提高万古霉素的发酵单位。

1 材 料

1.1 菌种

研究所用菌种为东方拟无枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02，由华北制药华胜有限公司提供。

1.2 培养基

1）种子培养基（除pH值外，其余物質含量均为质量浓度）

葡萄糖为20.0 g/L，蛋白胨为5.0 g/L，NaCl为5.0 g/L，K2HPO4为0.3 g/L，pH值为7.0～7.2。

2）发酵培养基（除pH值外，其余物质含量均为质量浓度）

葡萄糖为30.0 g/L，工业淀粉为80.0 g/L，酵母粉为10.0 g/L，低温豆粉为15.0 g/L，NaCl为1.0 g/L，KH2PO4为0.1 g/L，pH值为7.0～7.2。

1.3 主要原材料和仪器设备

1）原材料

葡萄糖，河北金锋淀粉糖醇有限公司提供;蛋白胨，石家庄赛特工贸有限公司提供;工业淀粉，河北兴柏药业集团有限公司提供;酵母粉，浙江东成生物科技股份有限公司提供;低温豆粉，栾城县通大工贸有限公司提供;无机盐，均由天津市永大化学试剂有限公司提供。

2）仪器设备

发酵摇瓶机（New Brunswick Scientific Innova 2300），Eppendorf公司提供;ARTP-IIS等离子诱变仪，无锡源清天木生物科技有限公司提供;LC-2030C高效液相色谱仪，岛津公司提供;PICO 21离心机，Thermo公司提供。

2 方 法

2.1 检测方法

1）菌体浓度的检测

采用PMV法（packed mass volume）测定菌体生物量[9]。

2）样品处理方法

取发酵液1.0 mL，用体积分数2.0%的硫酸溶液定容至10 mL，浸泡60～90 min，3 000 r/min离心10 min后取上清液进样。

3）HPLC检测色谱条件

色谱柱（Symmetry Shield RP18，4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-四氢呋喃-三乙胺水（pH值为3.2，体积分数为0.2%），三者体积比为7∶1∶92），柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL，检测波长为280 nm。

2.2 培养方法

1）斜面及平板培养

取冷冻保存的甘油管接入斜面培养基或诱变处理的单孢子悬液涂布于平板培养基，28 ℃培养6～8 d。

2）种子培养

挖取约0.5 cm2斜面孢子接入装有30 mL种子培养基的三角瓶中，摇床转速为220 r/min，28 ℃培养24 h。

3）发酵培养

种子培养液以体积分数5%的接种量接于装有30 mL发酵培养基的三角瓶中，摇床转速为220 r/min，28 ℃培养6 d放瓶。

4）50 L罐培养

采用两级发酵，母瓶种子液以体积分数0.5%接种于10 L种子培养基中，28 ℃培养48 h后以体积分数5%接种量转接于30 L发酵培养基中，发酵过程中通气比为1 m3/（m3·min-1），初始搅拌转速为350 r/min，发酵过程中通过控制搅拌调节溶氧量，保证最低溶氧量不低于20%（体积分数）。发酵50 h后用氨水控制pH值不低于7.2，28 ℃培养7 d放罐。

2.3 高产菌株选育

2.3.1 单孢子悬液的制备

取生长良好的斜面2支，加入无菌水洗下孢子，转入装有玻璃珠的三角瓶中，摇床120 r/min振荡15 min打散菌体，过滤后制备成约106个/mL的单孢子悬液。

2.3.2 链霉素最低抑制浓度的确定

取50 μL单孢子悬液分别涂布于含有不同浓度链霉素的平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。

2.3.3 复合诱变选育菌株

1）紫外诱变

取单孢子悬液置无菌平皿中，于紫外诱变箱（照射距离为30 cm，紫外功率为30 W）分别照射30，40，60，80，100 s，稀释涂布于平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。根据菌落大小和形态特征，每个诱变条件下挑选80～100个单菌落按照2.2项的方法进行筛选，计算突变率。

2）ARTP诱变

取单孢子悬液涂于金属载片上，于ARTP诱变箱（电源功率为110 W，工作气流量为10 L/min，照射距离为2 mm），分别处理15，30，45，60，90 s后，稀释涂布于平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。根据菌落大小和形态特征，每个诱变条件下挑选80～100个单菌落按照2.2项的方法进行筛选，计算突变率。

3）复合诱变

根据确定的最佳条件紫外照射60 s、ARTP诱变45 s，采用复合诱变处理万古霉素单孢子悬液。

2.3.4 链霉素抗性菌株选育

将复合诱变处理的单孢子悬液涂布于含链霉素1 500 μg/mL（质量浓度）的抗性平板上，长出的菌株即为抗性菌株，通过摇瓶试验筛选高产菌株。

2.4 发酵培养基优化

2.4.1 碳源的选择

选取葡萄糖、麦芽糖、糊精、淀粉、甘油作为基础碳源，进行单因素试验，考察碳源对万古霉素的影响。

2.4.2 氮源的选择

选取低温豆粉、高温豆粉、硫酸铵、酵母粉、蛋白胨、豆粕作为基础氮源，进行单因素试验，考察氮源对万古霉素的影响。

2.4.3 均匀设计优化培养基成分

选取单因素试验中影响效果较大的葡萄糖、淀粉、低温豆粉、酵母粉4个因素为自变量，分别用X1，X2，X3和X4表示，发酵效价为因变量，用Y表示;根据均匀设计V4.0版软件提供的模型设计实验，筛选高产菌株发酵的最适配方。

3 结果与分析

3.1 链霉素最低抑制浓度的确定

将东方拟无枝酸菌菌悬液涂布于链霉素抗性平板，随着抗性浓度的增加菌落生长越来越弱，当抗性浓度（质量浓度，下同）达1 500 μg/mL时，平板上无菌落生长，表明链霉素对东方拟无枝酸菌出发菌株的最低抑制浓度（质量浓度，下同）为1 500 μg/mL。

3.2 诱变条件的选择

对出发菌株诱变处理结果见表1和表2。由表可见，随着紫外（UV）和ARTP诱变处理时间延长，致死率越高，负突变率也越高，而正突变率呈上升又下降的趋势。紫外处理60 s时，致死率为95.4%，正突变率高达20.5%。ARTP处理45 s和60 s时，正突变率分别为18.7%和17.8%，相差不大，但负突变率差距明显，故选择45 s作为最佳处理时间。

3.3 复合诱变及链霉素抗性筛选

按照2.3.3项和2.3.4项的方法处理筛选万古霉素高产菌株，挑选出245个生长良好的单菌落，经多次摇瓶筛选，获得8株发酵水平提高20%以上的菌株，其中菌株V19-1-07提高幅度达到33.7%，结果见图1和表3。

经诱变处理后，东方拟无枝酸菌在平皿固体培养基上菌落形态突起、高耸，有褶皱或呈火山状突起，产孢子情况明显差异（见图2），从中挑取单菌落，用摇瓶试验筛选高产菌株。

3.4 高产菌株稳定性

菌株传代稳定性是决定其能否用于工业化生产的重要因素[10]。将选育的高产菌株V19-1-07采用斜面传代方式，考察稳定性，连续传代5次，进行摇瓶实验测定发酵效价，结果见表4。菌株V19-1-07从F1到F4代，发酵效价波动水平不超过10%，说明高产菌株具有良好的传代稳定性，有利于规模化工业生产。

3.5 发酵培养基优化

3.5.1 碳源的優化

微生物的生长繁殖和合成产物均离不开碳源物质。发酵工业中常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和小分子醇等。本研究选取葡萄糖、麦芽糖、糊精、淀粉、甘油为唯一碳源，考察不同碳源对高产菌株V19-1-07生长和合成万古霉素的影响，结果见图3。

由图3可知，淀粉和葡萄糖对东方拟无枝酸菌菌丝生长和合成产物均有利，发酵单位明显高于其他碳源，因此，选取淀粉和葡萄糖进行后续试验。

3.5.2 氮源的优化

发酵培养基中氮源主要用于菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物的合成。本研究选取低温豆粉、高温豆粉、硫酸铵、酵母粉、蛋白胨、豆粕分别作为唯一氮源，考察不同氮源对万古霉素高产菌株V19-1-07的影响，结果见图4。低温豆粉和酵母粉作为唯一氮源时，发酵液中万古霉素含量明显高于其他氮源，因此，选取酵母粉和低温豆粉作为氮源进行后续试验。

3.5.3 均匀设计优化培养基

按照2.4.3项的方法，设置4个因素、6个水平进行均匀设计优化，其中，4个因素分别为葡萄糖、淀粉、低温豆粉、酵母粉，赋值（质量分数，下同）范围分别为1.0%～8.0%，2.4%～8.0%，1.0%～4.0%，1.0%～4.0%，设计的U6（64）试验方案以及优化结果见表5。

利用均匀设计V4.0版软件进行分析，采用最优回归子集法得到发酵效价（Y）对4个因素（葡萄糖（X1）、淀粉（X2）、低温豆粉（X3）、酵母粉（X4））的回归方程：Y=277.106 526 3+899.378 027 7X1-77.148 630 8X1X1+112.085 849 6X1X4-18.138 399 4X2X3。

对回归方程的各项参数进行方差分析，结果见表6，得到的最优解见表7。

由回归方程的方差分析表6可见，相关系数R2值和p值都很合理，说明方程拟合很好，方程有极其显著的意义。确定的发酵培养基优化配方为葡萄糖8.0%，淀粉1.0%，低温豆粉1.0%，酵母粉4.0%，NaCl 1.0%，KH2PO4 0.1% 。

3.6 50 L发酵罐验证

采用优化后的培养基配方，使用2.2项的方法，在50 L发酵罐中进行配方验证，结果见表8。由表可见，被均匀设计试验优化后的培养基配方，使发酵效价较原来提高28.9%，高产菌株在50 L罐代谢曲线和发酵液检测结果如图5和图6所示。由图5可见，高产菌株V19-1-07在50 L发酵罐中，前40 h菌体生物量快速增长，总糖急剧下降，随着发酵时间延长，菌体缓慢增长，进入次级代谢阶段，产物快速合成，呈直线上升趋势。发酵160 h后溶氧量和pH值都开始回升，总糖质量浓度降至10 g/L左右，表明发酵结束。

4 讨 论

常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变是利用在常温（25～40 ℃）和常压下（1个标准大气压），产生高活性粒子（包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）的等离子体射流作用于生物体，影响细胞内的蛋白质活性，进而使微生物基因序列及其代谢网络发生变化，产生明显的诱变效果[11]。ARTP具有操作简单、突变稳定性好等特点。李磊[12]应用ARTP获得了小球藻突变株BYQ-1，生物量比出发株增加了13.24%。肖志强等[13]采用ARTP诱变处理黏着剑菌，筛选出高产维生素B12的诱变菌株，经过2轮ARTP诱变处理后摇瓶发酵单位相比于原始菌株提高了24.8%。张拴力等[14]采用ARTP诱变乳酸乳球菌，获得一株产乳酸链球菌素达到6 120 IU/mL的突变株。紫外和化学诱变等传统诱变育种方法是获得高产菌株的一种经济有效的方法，多年来一直应用于工业微生物菌种的改良。但是，长期、重复使用某种诱变源，往往导致突变率低、突变谱窄和抗性饱和[15]。两种或多种诱变剂同时使用的复合诱变处理可扩大突变的位点范围，增大获得正突变株的可能性。胡悦等[16]采用LiCl-ARTP复合诱变处理地衣芽孢杆菌，获得了高产碱性蛋白酶的优良菌株。黄玉等[17]用紫外和ARTP复合诱变金龟子绿僵菌，获得了产孢量高、耐紫外线、毒力强、遗传稳定的高性能优良菌株。

研究发现，链霉素抗性与核糖体蛋白上氨基酸残基的改变有关，这些特定位点的突变会启动菌体产生抗生素，从而提高次级代谢产物的产量[18-19]。目前核糖体工程中主要采用链霉素、利福霉素、庆大霉素等抗生素作为筛选压力，该方法能够快速提高抗生素的产量，耗费时间较少。鲁凤娟等[20]利用核糖体工程技术选育得到了米尔贝霉素的高产菌株，李文华等[21]应用该技术选育了卡伍尔链霉菌高产菌株。

本研究首次将ARTP诱变选育技术应用于东方拟无枝酸菌（Amycolatopsis orientalis），并结合紫外誘变和链霉素抗性筛选，对出发菌株万古霉素产生菌V19-02进行诱变育种，获得的高产菌株V19-1-07摇瓶发酵水平较出发菌株提高了33.7%，且具有良好的遗传稳定性，可用于万古霉素工业化发酵生产。

5 结 语

本研究通过复合诱变和抗性筛选选育万古霉素高产菌株，采用均匀设计优化发酵培养基配方，经50 L罐验证后，较初始提高28.9%。经选择诱变条件，结果发现，紫外诱变处理60 s 时正突变率为20.5%，ARTP诱变处理45 s时正突变率达18.7%，链霉素对东方拟无枝酸菌的最小抑制浓度为1 500 μg/mL，经以上诱变技术选育的高产菌株V19-1-07从F1到F4代，发酵效价波动水平不超过10%，遗传稳定，表明东方拟无枝酸对诱变处理较敏感，ARTP诱变和核糖体工程技术用于东方拟无枝酸菌诱变选育可行有效。通过均匀设计试验对筛选出的葡萄糖、淀粉、低温豆粉、酵母粉4个因素进行优化，优化后的发酵培养基配方中淀粉比例由初始的80 g/L降为10 g/L，降低了培养基的黏稠程度，有利于彻底灭菌，避免了染菌情况的出现。同时培养基变的稀薄，增加了溶氧的传递，有利于菌丝生长。

在链霉素抗性筛选过程中，以含链霉素最小抑制浓度1 500 μg/mL的抗性平板进行突变菌株筛选，进行摇瓶实验筛选得到链霉素抗性不小于1 500 μg/mL的突变菌株，复筛后获得8株发酵水平提高20%以上的菌株。下一步可继续考察这8株菌的链霉素抗性浓度，探索链霉素抗性与万古霉素产量之间的关系。均匀设计优化后的发酵培养基配方中葡萄糖质量浓度为80 g/L，由于葡萄糖含量较高，在以后的发酵工艺优化中可降低初始葡萄糖含量，采用补糖的方式提供碳源，考察分批补料发酵对万古霉素发酵的影响，该方式提高碳源的转化率，降低发酵成本，有利于企业竞争力的提升。

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