王 敏，蔡虎志，陈新宇，周 芳

(湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007)

慢性心力衰竭(Chronic heart failure，CHF)是因冠心病、高血压等心脏结构或功能性疾病进展而诱发的一组临床综合征，是各种心血管疾病的终末阶段[1]。CHF患者心功能受损，生活自理能力降低，流行病学调查显示，CHF发病率为0.9%～10.0%，且呈上升趋势，CHF已成为威胁公共健康的重大问题[2]。CHF属中医“水肿”“怔忡”“胸痹”范畴，中医认为胸痹、怔忡患者病位在心，涉及脾胃，临床多以本虚标实为主，本虚表现为气血亏虚或阳虚，标实则以痰湿血瘀多见。近年来，本院将自制的温阳振衰颗粒用于治疗慢性心衰患者，获得一定成效[3]，但其药理机制尚未完全阐明。目前临床多认为，心肌细胞因子及其相关信号通路在CHF中发挥重要作用[4]。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)是MAPK信号通路的主要亚族，其磷酸化表达与CHF病情进展呈显著正相关[5]。另外，外泌体是重要的细胞间信号物质转运载体，而miR-21作为p38MAPK上游非编码调控基因，研究显示，外泌体通过携带miR-21抑制p38MAPK信号通路[6]。故推测温阳振衰颗粒可能与调控外泌体miR-21和p38MAPK信号通路有关。基于此，本研究探讨温阳振衰颗粒对CHF大鼠外泌体miR-21和p38MAPK信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：取40只清洁级SD雄性大鼠，体重200～250 g，鼠龄8～12周，所有动物均由本院实验动物中心提供。大鼠在22～26 ℃温度常规适应性饲养1周。

1.1.2 实验药物与试剂：温阳振衰颗粒(湖南中医药大学第一附属医院制剂室自制制剂)，依那普利注射液(规格1 ml∶1.25 mg，国药准字X20010498，常州制药厂有限公司)，阿霉素注射液(国药准字H33021980，海正辉瑞制药有限公司)。外泌体Exo Quick抽提试剂盒(北京普迈精医科技有限公司)，miRNA cDNA Synthesis试剂盒(批号ZY130911，上海泽叶生物科技有限公司)，Werstern blot法一抗和二抗(批号SY4836，北京伊塔生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 建模、分组与给药：将40只大鼠随机分为正常组、模型组、依那普利组及温阳振衰组，每组10只。正常组大鼠继续以常规饲料喂养，另外三组采用阿霉素诱导建立CHF大鼠模型。具体方法：用0.9%氯化钠溶液将阿霉素配制成2.0 mg/ml浓度，腹腔注射1.5 ml/kg，1次/周，连续干预6周。在阿霉素诱导CHF建模完成后行超声检查，计算左室短袖缩短率(Fractional shortening，FS)，以心腔扩大、FS<30%为CHF建模成功[7]，模型组有2只大鼠因严重心力衰竭死亡，依那普利组1只因肝硬化腹水死亡，温阳振衰组2只死于严重心力衰竭，其余建模成功。以体重60 kg患者的临床药量为标准，按剂量-体表面积换算法计算大鼠用药量。正常组继续常规饲料喂养，未给予药物干预。模型组以0.9%氯化钠溶液灌胃，依那普利组以依那普利灌胃，温阳振衰组以温阳振衰颗粒剂灌胃，2次/d，连续干预4周。

1.2.2 标本采集：分别在灌胃前(阿霉素诱导CHF建模后)和灌胃后(灌胃完成后4周)采血，常规EDTA抗凝后，以3000 r/min，离心15 min，取上清液冷冻保存。采用Exo Quick试剂盒法提取血清中外泌体。具体步骤：取500 μl血浆与120 μl的Exo Quick试剂，混匀后静置30 min，室温低速离心30 min，收集沉淀，冷冻保存。在灌胃后4周麻醉处死大鼠，取出心脏，称重，冷冻备用。

1.2.3 RT-PCR法检测心肌组织和外泌体miR-21水平：采用Trizol法提取总RNA，采用miRNA cDNA Synthesis试剂盒进行逆转录，合成cDNA，以GAPDH为内参，并进行PCR扩增。反应体系：5 μl的cDNA，10×PCR Buffer 2.5 μl,dNTP 2 μl,上下游引物各1 μl，再加H2O2至25 μl。反应条件：95 ℃预变性30 s，90 ℃变性15 s，72 ℃退火1 min，60 ℃延伸45 s，共40个循环，以2-△△Ct记录相对表达量。

1.2.4 Werstern blot法检测p38MAPK蛋白、p38MAPK mRNA、p-p38MAPK蛋白及p-p38MAPK mRNA水平：取20 μg外泌体，行12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳处理，以0.22 μm PVDF膜、100 V恒压转膜40 min，室温下5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗(CD9 1∶500，CD63 1∶500)处理，TBST洗膜10 min×5次，再以二抗(山羊抗兔、抗鼠1∶5000稀释)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜10 min×5次，采用化学发光成像仪曝光，记录条带灰度值。

1.2.5 心功能指标：分别在灌胃前后行腹腔麻醉，起效后将大鼠平卧固定，将探头置于胸骨左缘，取左室长轴最大直径处M型超声标记室间隔、左室后壁收缩末、舒张末心内膜位置，记录左室射血分数(Left ventricular ejection fractions，LVEF)、E峰/A峰(E/A)、左室舒张末内径(Left ventricular end diastolic dimension,LVDD)及左室后壁厚度(Left ventricular posterior wall,LVPW)。

1.3 统计学方法 选用SPSS 22.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差表示，多组间行单因素方差分析，两两比较行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清外泌体miR-21水平比较 见表1。灌胃前，模型组、依那普利组及温阳振衰组血清外泌体miR-21水平均低于正常组。灌胃前后，四组大鼠血清外泌体miR-21水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃后，依那普利组和温阳振衰组血清外泌体miR-21水平均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃后，依那普利组、温阳振衰组血清外泌体miR-21水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠血清外泌体miR-21水平比较

2.2 各组大鼠心肌组织miR-21水平比较 正常组、模型组、依那普利组及温阳振衰组大鼠心肌miR-21 mRNA水平分别为(1.12±0.37)、(0.76±0.29)、(0.94±0.35)及(1.03±0.28)，组间比较，差异有统计学意义(F=58.05，P<0.01)。温阳振衰组和依那普利组大鼠miR-21 mRNA均高于模型组，差异有统计学意义(t=8.186、3.430，P<0.05)，但低于正常组(t=4.80，P<0.01)。依那普利组和温阳振衰组大鼠心肌miR-21 mRNA水平比较，差异无统计学意义(t=0.886，P>0.05)。

2.3 各组大鼠p38MAPK、p-p38MAPK mRNA和蛋白水平比较 见表2。四组大鼠心肌组织p38MAPK、p-p38MAPK mRNA和蛋白水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。正常组大鼠心肌组织p38MAPK、p-p38MAPK mRNA和蛋白水平均低于其他三组，差异有统计学意义(P<0.05)。温阳振衰组和依那普利组p38MAPK、p-p38MAPK mRNA和蛋白水平均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。依那普利组和温阳振衰组p38MAPK、p-p38MAPK mRNA和蛋白水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠p38MAPK、p-p38MAPK mRNA和蛋白水平比较

2.4 各组大鼠心功能指标比较 见表3。灌胃前和灌胃后，四组大鼠LVEF、E/A、LVDD及LVPW水平比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。灌胃前，正常组LVEF高于其他三组，E/A、LVDD及LVPW均低于其他三组，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃后，温阳振衰组和依那普利组LVEF高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。依那普利组和温阳振衰组E/A、LVDD及LVPW水平均低于模型组，差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠心功能指标比较

3 讨 论

中医虽无CHF病名，但根据其临床表现，CHF属中医“水肿”“怔忡”“胸痹”范畴[8]。《素问》记载：“阳气者，精则养神，柔则养筋。”若心阳不足，使机体失于温煦，进而产生痰浊、血瘀。因而，CHF多以本虚标实为主。温阳振衰颗粒是本院自制中药制剂，已在临床广泛应用。温阳振衰颗粒以制附子、红参为君，其中附子被称为扶阳第一要药，红参具有复脉固脱作用，二者联用发挥回阳救逆功效[9]；方中辅以干姜、茯苓作为臣药，其中干姜既能辅助附子，巩固回阳救逆之效，又与茯苓配伍以健脾渗湿；方中麦冬、五味子为佐，养阴生津、固护阳气[10]；甘草为使药，调和诸药，使全方达到温阳益气、固阳化阴之功。本研究显示，灌胃后温阳振衰组和依那普利组LVEF高于模型组，且温阳振衰组LVEF水平高于依那普利组，提示温阳振衰颗粒有助于改善CHF大鼠心功能，达到与依那普利相近的临床疗效。另外，灌胃后温阳振衰组与依那普利组E/A、LVDD及LVPW虽低于模型组，但差异无统计学意义，这可能与样本量小和观察时限较短有关。

miRNA/p38MAPK信号通路在CHD发生发展过程中发挥重要作用。p38MAPK是具有调控炎症反应和心肌细胞增殖作用的信号通路，心肌细胞p38MAPK信号增强，可直接诱导心肌细胞凋亡[11-13]。相关基础研究显示，抑制p38MAPK磷酸化能减少炎症因子分泌，改善心功能[14]。miRNA属内源性非编码小分子RNA，通过与靶基因mRNA的3’端非翻译区结合，产生负性调控作用，发挥生物学功能[15-16]。miR-21则是miRNA内源性非编码单链小分子成员，既往已有研究证实，miR-21在心肌细胞凋亡、心肌纤维化及平滑肌细胞增殖过程中均发挥重要作用，其作用与调控p38MAPK信号通路密切相关[17]。miR-21可介导p38MAPK信号通路调控炎症因子释放，进而缓解病情[18-19]。外泌体是含有mRNA、蛋白质的小膜泡，外泌体携带miR-21可减轻内质网应激，进而抑制p38MAPK信号，发挥抗心肌细胞凋亡作用。本研究显示，灌胃后温阳振衰组大鼠心肌p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表达量低于模型组，说明温阳振衰颗粒通过上调外泌体miR-21，阻断p38MAPK信号通路，抑制p38MAPK磷酸化，发挥抗心肌凋亡作用。但本研究纳入样本量小，结果仍有待进一步研究证实。另外，有研究显示，miR-21可通过下调张力蛋白表达抑制心肌细胞凋亡[20]，这可能是温阳振衰颗粒上调miR-21后发挥治疗作用的另一途径，但其具体机制和相关蛋白因子有待深入研究。

综上，温阳振衰颗粒治疗CHF疗效较好，其作用机制可能与其通过上调外泌体miR-21水平，抑制p38MAPK信号通路有关。