苓 苓，昂格力玛，宫菊花，吴圆圆，杜 兰，王 欢

(内蒙古民族大学 蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000)

幽门结扎性肝损伤模型为本课题组创新研究的新型肝损伤病症模型。其理论基础是基于蒙医“三根七素”理论的“精华与糟粕分解”理论，即人体新陈代谢过程，此过程中胃和肝脏起着关键作用，且相互密切相关，按精华与糟粕分解顺序，如前者无病变，则后者提供营养。幽门结扎性肝损伤模型与临床上幽门狭窄导致的相关疾病相似[1]。据前期蛋白质组学研究结果表明，幽门结扎后导致146个蛋白出现显著差异，其中上调1.5倍以上者有78个，下调1.5倍以上者有68个，其蛋白功能大部分与新陈代谢有关，部分与炎症介质有关，还有部分与免疫系统有关。通过基因芯片技术分析，有562个差异基因。其中大部分差异基因与新陈代谢有关，即药物代谢及谷胱甘肽、过氧化物酶、胆汁酸、脂肪酸代谢等[2]。目前，尚鲜有该病症模型病因机制研究的报道。

蒙药连翘-4别名音达日西汤、苏龙嘎-4汤，由连翘、麦冬、拳参、川木通等4种药物组成。其中连翘为主药，麦冬、拳参、川木通为辅助药，该药为凉性方剂，可祛热、止泻，主治大小肠之热痢疾、腹痛、腹泻等疾病[3]。目前，主要从抗炎、镇痛、抗腹泻、抑菌杀菌等方面对连翘-4进行了药效学研究[4-7]，研究发现，连翘-4对诸多因素导致的肝损伤有很好的保护作用，如连翘-4对“幽门结扎”性肝损伤和CCl4引起的急性肝损伤均起到明显的保护作用[1，8-9]，但也未发现有相关物质基础研究的报道。

因此，本研究采用体外细胞实验探讨幽门结扎性肝损伤病因机制及连翘-4保肝作用物质基础，为进一步研究提供参考。

1 实验材料

1.1 仪器

ICUBIO生化分析仪(深圳生物科技有限公司)；TB110显微镜(日本Nikon)；BCD 216ZDJ冰箱(青岛海尔有限公司)；3110 CO2恒温培养箱(美国，Thermo Scientific)；SW-CJ-2F双人超净工作台(苏州智净有限公司)；HH S26S恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；TDL-5-A离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试药

连翘-4组方药(购自内蒙古民族大学附属医院，批号：20181164)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：18090505)；RPMI-1640培养基(Solarbio公司，批号：20181130)；胰蛋白酶(Solarbio公司，批号：20190926)；双抗(Solarbio公司，批号：20181225)；二甲基亚砜(DMSO，Solarbio公司，批号：710N035)；1XPBS缓冲液(Solarbio公司，批号：20201117)；硫酸铜(天津市德恩化学试剂有限公司，批号：20191120)；75%乙醇或95%乙醇(天津市光复科技发展有限公司，批号：20180428)；谷氨酸氨基转移酶(ALT)(库贝尔公司，批号：201003)；天门冬氨酸基转移酶(AST)(库贝尔公司，批号：201001)。

1.3 细胞及动物

LO2细胞(人正常肝细胞)，由内蒙古民族大学蒙医药学院实验室提供，经本实验室传代后-80 ℃保存。

SD大鼠，体质量180～220 g，购自辽宁长盛生物有限公司，动物许可证号：SCXK(辽宁)2018-0001。饲养于内蒙古民族大学蒙医药学院净化动物室。

2 实验方法

2.1 试药准备

2.1.1 培养液制备 RPMI-1640培养基+10%胎牛血清。

2.1.2 冻存液制备 胎牛血清∶DMOS=9∶1的比例进行配制，现配现用。

2.1.3 含药血清制备 SD大鼠随机分成正常组、模型组(幽门结扎)、给药组(连翘-4，3.9 g/kg)各组20只，灌胃给药，空白组与模型组灌服0.5%CMC-Na溶液，给药标准均为2 mL/100 g，每日1次，连续15 d，末次给药后全部大鼠禁食不禁水24 h，模型组及给药组大鼠进行麻醉，在无菌情况下开腹幽门结扎，术后单笼饲养，禁食禁水18 h，麻醉，采腹主动脉血，3 000 r/min的转速下离心10 min，取清液层，56 ℃灭活30 min，微孔滤膜(0.22 μm)过滤除菌(超净工作台中进行)，室温冷却，于-80 ℃的低温冰箱中保存。

2.2 LO2细胞

2.2.1 细胞复苏 首先将细胞实验所需用品消毒表面后放于超净工作台内，紫外线照射30 min杀菌，再将低温保存的LO2细胞取出，在37 ℃水浴中融化(最好不超过1 min)，加入10 mL培养基混匀，将离心机调至1 000 r/min，离心5 min，吸掉上清，加1～2 mL完全培养基，吹匀，再移入含培养基的培养瓶，培养于CO2培养箱(5%CO2、37 ℃)。每日观察细胞状态，以培养基颜色和细胞状态决定是否要换液。

2.2.2 细胞传代 待细胞生长融合达80%时，吸掉旧培养液，灭菌PBS洗1～2次，加1 mL胰酶消化，37 ℃静置1～2 min，镜下观察LO2肝细胞的消化情况，当细胞变圆收缩且大量脱落时，终止消化，1 000 r/min的转速下离心5 min，吸掉上清液，加完全培养基吹匀，再分2瓶，放入5%的CO2培养箱，37 ℃培养。

2.2.3 细胞冻存 弃旧完全培养基，洗涤和消化LO2肝细胞，再终止其消化，离心去清液层，加入冻存液重悬，计数(最终密度调整至 5×106/mL～1×107/mL)，分装。分装后在冻存管上标明日期、细胞名称及保种人等，再置4 ℃→30 min；再置-20 ℃→2 h；最后放置于-80 ℃冰箱。

细胞计数：消化细胞制成细胞悬液。盖片覆盖至计数板，细胞悬液吸取10 μL，打入盖片下，铺满计数板与盖片间，静置1 min，计算4大格细胞计数总数(数上不数下，数左不数右)，计算公式：细胞数(mL)=4大格细胞总数/4×104[10]。

2.3 各组血清对LO2肝细胞的影响

取处于指数生长期的LO2肝细胞，进行洗涤和消化，加入适量完全培养基(调整最终浓度为5×104/mL)，再将细胞悬液接种于96孔板，200 μL/孔，预培养24 h，吸掉旧液。分为空白组(A组)，模型组(门静脉血清B组)，正常大鼠门静脉血清组(C组)，含药血清组(连翘-4腹主动脉含药血清D组)血清浓度均为20%，每孔200 μL，培养12 h(条件为5%CO2，37 ℃)，观察细胞生长状态。

2.4 细胞形态观察

用倒置相差显微镜观察LO2肝细胞的形态和生长状况。

2.5 统计学处理

3 实验结果

各组血清对LO2细胞的影响：与空白组比较，正常大鼠门静脉血清组对LO2细胞上清液AST、ALT的水平具有明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)；与正常大鼠门静脉血清组比较，模型对照门静脉血清组对LO2细胞上清液AST、ALT的水平具有极显著提高，差异有统计学意义(P<0.01)。在显微镜下观察LO2肝细胞发现，正常组细胞状态良好，大小均匀，边界清晰；模型对照门静脉血清组细胞数量明显减少，细胞明显融合。模型对照门静脉血清组与连翘-4腹主动脉含药血清组比较，细胞上清液AST、ALT和镜下观察均未发现明显变化。见表1和图1。

表1 各组血清对LO2细胞肝功能指标的影响

注：A空白组；B模型组(门静脉血清)；C正常大鼠门静脉血清组；D连翘-4腹主动脉含药血清组。

4 讨论

与空白组比较，模型组门静脉血清对LO2细胞上清液AST、ALT的水平提高显著，具有统计学意义(P<0.01)。在倒置相差显微镜下观察发现，正常组细胞生长状态良好，大小均匀，边界清楚；模型组细胞数量明显减少，细胞明显融合。与模型组门静脉血清比较，连翘-4含药血清组细胞上清液AST、ALT的差异无统计学意义。在倒置相差显微镜下观察发现无明显变化。此结果吻合与蒙医基础理论——“精华与糟粕分解”。本研究中大鼠胃幽门结扎后胃内引起胃酸过多而导致“胃溃疡”，进一步诱发“肝功能异常”，甚至引起十二指肠溃疡。在此过程中，幽门结扎时胃内“消化三能”平衡被破坏(胃酸过多，即消化希拉过多)，导致“精华与糟粕分解”紊乱，进入肝脏的食物精华之精华质量受到影响而导致肝损伤。

综上，通过本次研究，初步判断幽门结扎致肝损伤的病理过程有可能来源于肝脏门静脉。但由于实验方法与测量误差等原因，从连翘-4腹主动脉血清内未发现保肝作用的有效物质基础，因此对该方药保护幽门结扎性肝损伤的有效物质基础方面还需进一步探索。