殷启凯,刘文婧,王国玮,张维嘉,付士红,韩 坤,许崇晓,许松涛,李 樊,刘亚宁,何 英, 王振海, 聂 凯, 王环宇

马达里亚加病毒(Madariaga virus, MADV)属于披膜病毒科，甲病毒属，过去被认为是东方马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus, EEEV)的南美洲分支，又称南美东方马脑炎病毒[1]。东方马脑炎病毒最开始分为4个亚型(Ⅰ～Ⅳ)，Ⅰ型常见于美洲北部，被称为North America(NA)型，Ⅱ-Ⅳ型主要分布于美洲南部和中部，被称为South America(SA)型[2]，由于两者在基因组、生态学和致病机制上具有显著差异，后直接将SA型单独定义为MADV[3]，2020年ICTV将其分类为一个独立的病毒。MADV为直径70 nm左右、表面有纤突的球形包膜病毒，基因组大小约11.7 kb，为单股正链RNA病毒[4]。目前认为MADV的传播媒介主要是库蚊，而且 MADV感染与寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)、登革病毒(Dengue virus, DENV)具有相似的临床表现，往往造成严重的后遗症[2]。近年来，MADV在巴西[5]、海地[2]、巴拿马[6]等拉丁美洲国家时常暴发，虽然我国目前尚未发现MADV的感染与传播，但随着经济全球化进程的推进和国家“一带一路”重大战略的实施，国外媒介传播病原体传入我国的风险日益增高，建立相应的高效快速检测方法日趋迫切。本研究基于TaqMan RT-PCR技术针对MADV建立了早期、快速检测方法，为MADV的检测、监测及相关研究提供实验室支持。

1 材料与方法

1.1 引物、探针的设计与合成 从GenBank中下载MADV的全部序列，通过Clustal X进行多序列比对分析，使用Primer Express(ABI公司，Ver：3.0)选择MADV保守性较高的NSP1区段，根据引物设计原则[7]设计特异性引物及TaqMan探针，引物和探针由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.2 MADV RNA标准品的制备 根据多序列比对分析的结果，选择将MADV NSP1基因的保守区(134～208 bp，GI:MH359233.1)克隆至pUC57-Amp载体获得pUC57-MADV质粒(苏州泓迅生物科技股份有限公司)。……