张舸 张宏 刘杨 李德国

摘要：依据GB 5009.28—2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》，采用高效液相色谱法，对焙烤食品中的苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量进行同时测定。焙烤食品样品被制备成粉末后，经正己烷脱脂、水浴超声提取、沉淀剂沉淀脱蛋白、离心等处理后，去除杂质的溶液经色谱柱分离紫外检测器检测后，根据保留时间定性，峰面积外标法定量。结果显示：苯甲酸、山梨酸和糖精钠3种被分析物，校准曲线最佳线性范围为0.5～100 mg/L，线性相关系数R均大于0.999 8，检出限均为0.005 g/kg，样品加标回收率范围90%～110%，相对标准偏差（RSD）2%～8%。该方法具有线性关系良好、操作简单、快速准确等优点，适用于焙烤食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的同时检测。

关键词：苯甲酸；山梨酸；糖精钠；高效液相色谱；焙烤食品

中图分类号：TS207.3 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20220420

Determination of Benzoic Acid Sorbic Acid and Saccharin Sodium in Baked Food by High Performance Liquid Chromatograhy

Zhang Ge1， Zhang Hong1， Liu Yang1， Li Deguo2

（ 1. Siping Product Quality Inspection Institute， Siping， Jilin 136000； 2. Gongzhuling Grain Bureau， Changchun， Jilin 136100 ）

Abstract： According to the national food safety standard for the determination of benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium in food （GB 5009.28—2016）， the contents of preservatives benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium in baked food were determined simultaneously by HPLC. After the baked food sample was prepared into powder， the sample treated with n-hexane degreasing， water bath ultrasound， precipitant protein precipitation， centrifugal clarification， etc. After removing impurities， the solution was separated by chromatographic column and detected by ultraviolet detector. Qualitatively according to retention time and quantitative by peak area external standard method. The results showed that the best linear range of calibration curve for benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium was 0.5 ～ 100 mg/L， the linear correlation coefficient R was greater than 0.999 8， the detection limit was 0.005 g/kg， the recovery range was 90% ～ 110%， and the relative standard deviation （RSD） was 2% ～ 8%. The results showed that the method has the advantages of good linear relationship， simple operation， rapid and accurate. It is suitable for the simultaneous determination of benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium in baked food.

Key words： benzoic acid， sorbic acid， saccharin sodium， high performance liquid chromatography， baked food

苯甲酸及其鈉盐和山梨酸及其钾盐在酸性条件下，对霉菌、酵母菌和许多好气菌均有抑制作用，是食品中常用的防腐剂。由于苯甲酸和山梨酸水溶性差，大多以苯甲酸钠和山梨酸钾的形式添加到食品中，食品中这两种防腐剂的含量是以苯甲酸和山梨酸计。长期过量食用苯甲酸，易发生荨麻疹、哮喘及血管性水肿等一系列过敏症状。与苯甲酸相比，山梨酸毒性小，但防腐效果更好，被广泛用于乳及乳制品、面包、糕点、饼干、果汁、果酱、酱醋菜和水产品等食品的防腐。糖精钠即糖精是一种人工合成的甜味剂、增味剂，其甜度为蔗糖的200～300倍，但人过量摄入糖精会影响肠胃消化酶的正常分泌，降低小肠的吸收能力，使食欲减退，而且糖精钠还有致畸、致癌和致遗传损害的可能性[1]。

苯甲酸（钠）、山梨酸（钾）和糖精钠因其价格低廉，在食品工业被广泛使用。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）规定：苯甲酸（钠）和糖精钠的使用范围不包括焙烤食品，山梨酸（钾）除了面包、糕点和饼干限量使用，其他的焙烤食品都不在使用范围内也只能限量使用。近年来，各地市场监督监督管理部门对糕点和饼干等焙烤食品抽检结果显示，苯甲酸（钠）、山梨酸（钾）和糖精钠3种食品添加剂均有超范围、超限量使用现象。不法生产企业、个人为了延长产品保质期和降低成本，在焙烤食品中超量使用山梨酸，违规使用苯甲酸和糖精钠，侵害消费者利益。因此，对焙烤食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定十分重要。

苯甲酸、山梨酸和糖精钠的国标测定方法中有气相色谱法（GC）和高效液相色谱法（HPLC）。与HPLC法相比，GC法分离度和准确度相对较差、操作复杂，且所用试剂乙醚毒性大，不利于检验人员的身体健康[2]。因此，本研究采用高效液相色谱法，同时测定焙烤类食品中的苯甲酸、山梨酸和糖精钠，以期为食品安全检测部门提供有效检验方法及数据。

1 材料与方法

1.1 试剂材料

苯甲酸（GBW（E）100006）、山梨酸（GBW（E）100007）、糖精钠（GBW（E）100008）标准物质：1 000 mg/L，中国计量科学研究院；甲醇（色谱级）：德国默克有限公司；焙烤食品阴性样品：无任何添加剂的自制奶油蛋糕。

1.2 仪器设备

LC-20型高效液相色谱仪：配紫外檢测器，岛津企业管理（中国）有限公司；ME203型千分之一电子天平：梅特勒-托利多科技（中国）有限公司；KQ-500DE型超声波发生器：昆山市超声仪器有限公司；XW-80A型涡旋混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 试剂配制

亚铁氰化钾溶液（92 g/L）：取26.5 g亚铁氰化钾，适量水溶解后，水定容至250 mL。

乙酸锌溶液（183 g/L）：取55 g乙酸锌少量水溶解后，加入30 mL冰乙酸，水定容至250 mL。

乙酸铵溶液（0.02 mol/L）：取1.54 g乙酸铵少量水溶解后，水定容至1 000 mL，0.22 μm水相滤膜过滤。临用前配制脱气。

氨水溶液（1+99）：氨水1 mL加99 mL水。

1.4 标准溶液配制

混合标准中间液（100 mg/L）：分别准确吸取质量浓度为1 000 mg/L的苯甲酸、山梨酸和糖精钠（以糖精计）标准溶液各1 mL，用水定容至10 mL。

混合标准系列工作溶液：分别准确吸取混合标准中间0.002、0.004、0.005、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mL，用水定容至10 mL，配制成质量浓度0.2、0.4、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 mg/L的混合标准系列工作液，临用现配。

单标溶液的配制：分别吸取质量浓度为1 000 mg/L的苯甲酸、山梨酸和糖精钠（以糖精计）标准溶液各0.5 mL，分别用水定容至10 mL，配制成质量浓度为50.0 mg/L的单标溶液。

1.5 色谱分析条件

色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm×5 μm；流动相：A为20 mmol/L乙酸铵，B为甲醇，VA∶VB=95∶5；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；柱温：25 ℃；紫外检测波长：230 nm。

1.6 样品前处理

试样制备：将样品中半固态样品部分用组织匀浆机匀浆，固体样品部分用研磨机粉碎，搅拌均匀后，倒入组织匀浆机中和前者一起搅拌均匀。

试样提取：称取2.000 g样品于50 mL离心管中，加10 mL正己烷，60 ℃水浴加热5 min，不时轻摇，待脂肪溶解后，加25 mL氨水溶液（1+99），1 mL乙醇，涡旋混匀，50 ℃水浴超声20 min，冷却至室温后，再加入2.0 mL饱和硼砂溶液，摇匀后，加入2.0 mL亚铁氰化钾溶液、2.0 mL乙酸锌溶液，混匀，8 000 r/min离心5 min，弃去有机相，水相转移至50 mL容量瓶中，残渣加20 mL水，涡旋混匀后50 ℃超声5 min，8 000 r/min离心5 min，弃去有机相，水相转移至同一50 mL离心管中，取适量上清液过0.22 μm滤膜，作为待测液。

1.7 标准曲线的制作

按照1.5的色谱分析条件，将混合标准系列工作溶液从低浓度到高浓度进行测定，记录保留时间和峰面积，每个浓度重复进样2次，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制3种分析物的标准曲线。

2 结果与分析

2.1 色谱分析条件及样品前处理方法的选择

2.1.1 紫外检测波长的选择

选择最佳波长对于提高检测结果的精确度和灵敏度具有重要意义[3]。将山梨酸、苯甲酸和糖精钠的标准样品在200～300 nm检测波长处进行扫描，它们的最大吸收波长分别为254 、223 、202 nm，3种物质在230 nm附近均具有理想吸收，故选用230 nm为检测波长。

2.1.2 流动相的选择

甲醇可以改变流动相的极性，流动相的配比能改变组分分离情况，改善峰型，提高分离度[4]。固定其他实验条件，选择质量浓度为10.0 mg/L的混标，在流动相配比（VA∶VB）分别为90∶10、93∶7、95∶5下进行分析，观察3种被分析物的分离度和出峰时间。结果表明：随着甲醇在流动相中比例的增大，分离度减少，出峰时间缩短，在VA∶VB为95∶5时，3种被分析物的分离效果和峰型均较好，在18 min内能够完成苯甲酸、山梨酸和糖精钠的分析。所以选择体积比为95∶5的乙酸铵（0.02 mol/L）—甲醇混合液作为流动相。

2.1.3 沉淀剂的选择

常用的蛋白质沉淀剂有硫酸锌、亚铁氰化钾、乙酸锌、硫酸铜、氢氧化钠等，选用106 g/L的亚铁氰化钾溶液和220 g/L的乙酸锌溶液各2.0 mL时，处理液沉淀明显，上清液清晰，可以最大限度地去除杂质，满足实验要求[5-7]。

2.2 苯甲酸、山梨酸、糖精钠定性及定量分析

按照1.5的色谱分析条件，先将10.0 mg/L的混标进样分析，再将单标质量浓度为50.0 mg/L的3种被分析物分别进样，根据它们的保留时间，确定3种物质，色谱图见图1。

由图1可知，苯甲酸、山梨酸、糖精钠获得了良好的分离且互不干扰测定，样品干扰少，峰形好。3种物质的保留时间分别为9.679、13.590、17.723 min。

将试样待测液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中苯甲酸、山梨酸和糖精钠 （以糖精计）的质量浓度。

2.3 方法的线性关系

3种被分析物的标準曲线的线性方程和相关系数见表1。

结果表明：苯甲酸和山梨酸在0.2～100 mg/L范围内，糖精钠在0.5～100 mg/L范围内具有良好的线性关系，线性相关系数R均大于0.999 8，符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）附录F的要求。

2.4 检出限测定

利用液相色谱相关软件计算检出限，以3倍信噪比（S/N=3）对应的浓度为检出限。在取样量2 g，定容50 mL时，苯甲酸、山梨酸和糖精钠（以糖精计）的检出限均为0.005 g/kg。

2.5 准确性和可靠性

2.5.1 加标回收率和方法重复性测定

选择方法测定底限、在粮食中的残留量限量和任选一点3个水平，在阴性样品中同时添加苯甲酸、山梨酸和糖精钠，按照1.5色谱条件每个水平进行6次重复实验，添加浓度、检测结果及方法重复性（RSD）测定结果见表2。

2.5.2 仪器重复性测定

选择1、40 mg/L两个质量浓度的苯甲酸、山梨酸和糖精钠标准混合液注入色谱仪，在1.5色谱条件下重复进样6次，计算RSD值，测定结果见表3。

从表2和表3可以看出，本方法三水平添加苯甲酸、山梨酸和糖精钠的回收率在90%～110%，方法和仪器重复性测定的相对标准偏差（RSD）在2%～8%。说明该方法检测的准确性和可靠性良好，符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/ T 27404—2008）要求。

3 结 论

选用正己烷、氨水—乙醇溶液、乙酸锌、亚铁氰化钾、硼砂去除脂肪和蛋白质等大分子杂质，样品处理液的上层液澄清，上层液能顺利通过滤膜，此样品处理方法不仅干扰少、峰形好，测定结果准确，还可以降低柱压、减少色谱柱的污染，延长其使用寿命。使用本方法要注意的是：标准溶液应选用有效期内的；苯甲酸、山梨酸和糖精钠标准工作液容易降解，不能放置过久，宜现配现用。实验结果表明，本方法具有线性关系、准确性、精密度好，出峰时间快、峰形好、分离度好等优点，适用于烘焙食品中的苯甲酸、山梨酸和糖精钠的同时测定。

参 考 文 献

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