陈长兴　仲卫红　金灵璐　李莹莹　郑志煌　赵楠　付长龙

①采用回流法制备乌头汤药物；②软骨细胞培养、LPS诱导软骨细胞退变及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色法进行鉴定；③采用ELISA法检测软骨细胞上清液中一氧化氮（NO）与超氧化物歧化酶（SOD）水平变化；

④采用Western blot法检测软骨细胞中核因子NF-E2相关因子（Nrf2）、肌动蛋白结合蛋白（Keap1）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白含量表达。结果：①ELISA检测结果显示，与模型对照组比较，乌头汤各浓度组中的NO水平下降（P < 0.01），而SOD水平明显增高（P < 0.01）；②Western blot检测结果显示，乌头汤组（150 ?g·mL^-1）对脂多糖诱导的软骨细胞干预24 h后，可显著改善软骨细胞中Nrf2、Keap1、iNOS含量表达（P < 0.01）。结论：乌头汤可抑制膝骨关节炎软骨细胞氧化应激反应，其作用机制与调控Nrf2/Keap1途径相关。

【关键词】 膝骨关节炎；乌头汤；软骨细胞；氧化应激反应；大鼠

Study on the Inhibitory Effect of Wutou Tang（乌头汤）on Oxidative Stress Response of Chondrocytes in Knee Osteoarthritis

CHEN Chang-xing，ZHONG Wei-hong，JIN Ling-lu，LI Ying-ying，ZHENG Zhi-huang，ZHAO Nan，FU Chang-long

【ABSTRACT】Objective：To investigate the pathway and mechanism of Wutou Tang（乌头汤）in inhibiting oxidative stress response of chondrocytes in knee osteoarthritis.Methods：①Wutou Tang was prepared by reflux method;②Chondrocytes were cultured，LPS induced chondrocyte degeneration was made and typeⅡcollagen immunohistochemical staining was used for identification;③The levels of NO and SOD in the supernatant of chondrocytes were detected by ELISA;④Western blot was used to detect the expressions of Nrf2，Keap1 and iNOS in chondrocytes.Results：①The results of ELISA showed that compared with the model group，the level of NO in each concentration group of Wutou Tang decreased（P < 0.01），while the level of SOD increased significantly（P < 0.01）;②Western blot results showed that Wutou Tang group（150 ?g·mL^-1）could significantly improve the expression of Nrf2，Keap1 and iNOS in chondrocytes after 24 h of intervention on lipopolysaccharide induced chondrocytes（P < 0.01）.Conclusion：Wutou Tang can inhibit the oxidative stress response of chondrocytes in knee osteoarthritis，and its mechanism is related to the pathway of regulating Nrf2/Keap1.

【Keywords】 knee osteoarthritis;Wutou Tang（烏头汤）;chondrocytes;oxidative stress reaction;rats

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种在异常生物学及力学等多因素叠加影响下，可引起包括关节软骨、滑膜、软骨下骨结构与功能正常偶联失衡的关节疾病［1-2］。KOA好发于中老年人群，其临床症状（疼痛、关节活动不利等）严重影响中老年人的生活质量，因此，对其防治具有重要意义［3］。KOA属中医学“膝骨痹”范畴，恰如《素问·痹论篇》记载：“所谓痹者，各以其时，重感于风寒湿之气也。”故对膝骨痹的施治宜行扶正祛邪、祛寒除湿、温经通络之法［4］。

乌头汤出自《金匮要略》，是临床治疗膝骨痹的常用经方，具有扶正祛邪、祛寒除湿、利达关节之效，被中华中医药学会风湿病分会发布的《骨关节炎病证结合诊疗指南》列为强推荐［5］。诸多研究表明，软骨细胞发生氧化应激反应是加剧KOA软骨损伤的重要事件，而与氧化应激反应密切相关的核因子NF-E2相关因子（Nrf2）/肌动蛋白结合蛋白（Keap1）Nrf2/Keap1信号途径及一氧化氮（NO）与超氧化物歧化酶（SOD）调节因子的水平变化在KOA软骨退变病理进程中扮演了重要角色［6-7］。课题组前期通过计算机（网络）模拟分析发现，乌头汤可靶向作用于诱导型一氧化氮合酶（iNOS）等信号分子及关联途径，发挥抗氧化作用［8］，为进一步验证并阐明其治疗机制。本研究拟从Nrf2/Keap1信号途径为切入点，探讨乌头汤抑制KOA软骨细胞氧化应激反应的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠25只，雄性，4周龄，体质量（90±5）g。实验动物生产许可证SCXK（沪）2017-0005。饲养于福建中医药大学实验动物中心，恒温25 ℃，湿度55%～60%。实验动物使用许可证SYXK（闽）2019-0007。以上大鼠用于体外软骨细胞的培养。

1.2 实验药物 乌头汤（药物组成：制川乌6 g，麻黄、黄芪、白芍、炙甘草各9 g）由福建中医药大学附属第三人民医院提供。

1.3 实验试剂与仪器 磷酸盐缓冲液（批号ZNF1159，HyClone）；DMEM/LOW GLUCOSE（批号NZE1151，HyClone）；PageRuler（批号00156179，Thermo）；1-StepTM Transfer Buffer（批号PA196400，Thermo）；Nrf2（批号00083622，Proteintech Group，Inc）、Keap1（批号00084319，Proteintech Group，Inc）、iNOS（批号00080373，Proteintech Group，Inc），GAPDH（批号9306，Signal way Antibody LLC）等；Western blot凝胶成像系统（型号GELDOC 2000，美国BIO-RAD）等。

2 实验方法

2.1 药物准备及软骨细胞的培养 乌头汤药材经浸泡后，再依次经水回流、抽滤、浓缩、过滤等步骤，配成乌头汤母液（10 mg·mL^-1），放置低温下储存。实验大鼠经麻醉（质量分数为5%的异氟醚）成功后，依次清洗、剥离膝关节，分离与收集大鼠膝关节处软骨组织。经多次漂洗（PBS）后，进行修块、PBS反复洗净、消化（质量分顺为0.2%的Ⅱ型胶原酶）、收集、吹洗、铺板、传代等步骤，进行软骨细胞的体外培养（具体步骤参照课题组前期研

究）［9］。本实验使用第2代软骨细胞。

2.2 软骨细胞退变模型的复制 参照课题组前期方式复制软骨细胞退变模型（LPS 10 ng·mL^-1，干预8 h）［9］。具体步骤如下：将第2代软骨细胞的重悬液（计数2500个·mL^-1）种植于培养瓶中央；加入软骨细胞培养基后，转移至培养箱中进行孵育；待细胞铺满至90%空间时，移入10 ng·mL^-1LPS干预软骨细胞8 h，制备软骨细胞退变模型。

2.3 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色法鉴定 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：依次经PBS漂洗、固定（质量分数为4%的中性多聚甲醛）、再漂洗、裂解（质量分数为0.1%的破膜剂）、质量分数为3%的H2O2孵育、质量分数为5%的BSA封闭；阳性对照组置于含Ⅱ型胶原一抗（1∶200）中进行孵化过夜；阴性对照组用PBS代替，漂洗后加入

二抗（羊抗兔1∶200）反应30 min；再经DAB溶液浸润反应10 min，苏木素复染、返蓝、常温晾干，后依次经脱水、梯度二甲苯完成透明，待封固（中性树脂）后进行镜下观察。

2.4 ELISA检测软骨细胞上清液NO与SOD水平变化 使用6孔板接种及孵育软骨细胞，待爬片后，进行分组与干预，分组：空白对照组、模型对照组（LPS诱导8 h后更换含体积分数为10%的胎牛血清DMEM继续培养）、乌头汤组（LPS诱导8 h后，更换0，50，100，150，200，400，600 ?g·mL^-1的WTD进行后续干预24 h）。待干预完成后，参照ELISA试剂盒步骤，进行NO与SOD水平检测。

2.5 Western blot检测Nrf2、Keap1、iNOS蛋白含量表达 提取其总蛋白成分，进行BCA浓度分析；先配制体积分数为12%的下层胶（分离胶），利用蒸馏水重力施压胶面确保同水平面后，待其凝固后吸净上层蒸馏水，再配體积分数为5%的上层胶（浓缩胶）予以灌板，迅速插入梳子，待完全凝固后拔出梳子备用；操作移液枪以每孔20 μg进行上样，后依次经电泳（前10 min调20 V电压，再30 min调50 V，后100 V跑至胶底）、转膜（电流为1.3 A、电压25 V）、封闭后，再将各条膜置于预先配置好的Nrf2、Keap1、iNOS的一抗中，

4 ℃条件下均匀震荡过夜；经二抗反应完成后，进行显影、成像、分析结果。

2.6 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用t检验与单因素方差分析进行组间比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 软骨细胞培养及鉴定结果 第2代软骨细胞在镜下视野中排列紧致，大小一致，胞体充实饱满，见图1（1）。软骨细胞经Ⅱ型胶原染料浸染后，阳性对照组胞浆区浸染为棕黄色，见图1（2）。阴性对照组胞浆区则呈透明状，见图1（3）。

3.2 ELISA检测结果 与空白对照组比较，模型对照组、乌头汤各浓度组NO水平升高（P < 0.01），SOD水平则明显降低（P < 0.01）。与模型对照组比较，乌头汤各浓度组NO水平降低（P < 0.01），SOD水平升高（P < 0.01）。见表1。

3.3 Western blot检测软骨细胞中Nrf2、Keap1、iNOS蛋白含量比较 与空白对照组比较，模型对照组Keap1、iNOS蛋白含量表达显著增高（P < 0.01），Nrf2蛋白含量表达呈降低趋势（P < 0.01）；与模型对照组比较，乌头汤150 ?g·mL^-1组的Keap1、iNOS蛋白含量表达显著降低（P < 0.01），且Nrf2蛋白含量表达上调（P < 0.01）。

见表2。提示乌头汤可调节Nrf2/Keap1途径，发挥抗氧化作用，延缓其退变进程。各组软骨细胞中Nrf2、Keap1、iNOS蛋白电泳图，见图2。

4 讨 论

KOA主要病因为膝关节处关节软骨的异常退变，而关节软骨细胞氧化应激反应则可加剧KOA的病理进程［10］。研究表明，KOA发生后，伴随炎症反应的放大与升级，可加速iNOS的激活，且活化的iNOS可经结合反应（与精氨酸）促使NO的生成，而异常升高的NO可进一步通过致损作用（细胞毒或凋亡）加剧软骨细胞退变［11-12］。SOD可发挥拮抗或清除氧自由基作用，减轻炎症反应程度，从而保护软骨细胞免受过氧化作用的损害［13-14］。随着对氧化应激反应与软骨细胞退变之间作用关系的深入研究，发现Nrf2/Keap1信号途径可参与氧化应激反应，并对KOA软骨细胞退变的调控产生重要影响［15-16］。正常生理条件下，Nrf2可偶联Keap1共生于软骨细胞质中并经泛素化降解，而一旦受到异常氧自由基（NO等）及致炎因子（LPS等）刺激，原来的Nrf2与Keap1结合态发生解离，进一步诱使Nrf2产生活化效应并移于细胞核与抗氧化元件（ARE）结合，产生转录效应，从而降低异常氧化应激物质的聚集，发挥清除氧自由基作用［17］。简言之，KOA发生后，关节软骨细胞异常表达iNOS，活化的iNOS促使NO的释放，而NO作为活性氧的重要介质之一，可促使Nrf2与Keap1发生解离，进而激活Nrf2/Keap1信号途径。

本研究结果显示，乌头汤可降低LPS诱导的软骨细胞中iNOS异常表达，改善软骨细胞中NO与SOD水平，进而调控Nrf2/Keap1信号途径，在一定程度上发挥抗氧化作用，这亦与课题组前期网络药理学预测结果一致。此外，经Western blot检测发现，乌头汤（150 ?g·mL^-1）作用于软骨细胞（LPS诱导）后，可改善退变软骨细胞中异常表达的Keap1、Nrf2、iNOS的蛋白含量，推测乌头汤通过降低LPS诱导的退变软骨细胞中NO水平，升高SOD水平，且激活Nrf2/Keap1信号途径中的关联调节因子，发挥抗氧化作用。结合前期实验研究结果，即乌头汤（150 ?g·mL^-1）通过降低LPS诱导的软骨细胞中炎症反应（NF-κB途径）［9］，进而丰富与诠释了乌头汤可減轻KOA患者的关节疼痛程度，提高Lysholm膝关节功能评分，改善并提高膝关节活动度的作用机制［18］，为阐明乌头汤治疗KOA的效用机制并为临床应用提供科学依据。总之，乌头汤可抑制KOA软骨细胞氧化应激反应，其作用机制与调控Nrf2/Keap1途径相关。

参考文献

［1］ BERENBAUM F，WALKER C.Osteoarthritis and inflammation：a serious disease with overlapping phenotypic patterns［J］.Postgrad Med，2020，132（4）：377-384.

［2］ ABRAMOFF B，CALDERA FE.Osteoarthritis：pathology，

diagnosis，and treatment options［J］.Med Clin North Am，2020，104（2）：293-311.

［3］ 陈俊，林洁，赵忠胜，等.乌头汤对膝骨关节炎模型大鼠滑膜组织TLR4/NF-κB信号通路的影响［J］.中国组织工程研究，2019，23（27）：4381-4386.

［4］ 李满意，刘红艳，陈传榜，等.骨痹的证治［J］.风湿病与关节炎，2020，9（12）：53-56.

［5］ 姜泉，罗成贵，巩勋，等.骨关节炎病证结合诊疗指南［J］.中华中医药杂志，2021，36（2）：929-933.

［6］ 曹燕，李雪萍.氧化应激在骨关节炎中的研究进

展［J］.医学综述，2021，27（19）：3779-3784.

［7］ 周巧，刘健，宋倩，等.膝骨关节炎患者外周血单个核细胞CD36表达与氧化应激的相关性研究［J］.风湿病与关节炎，2021，10（3）：6-10，27.

［8］ 郑春松，林洁，付长龙，等.基于计算机模拟乌头汤治疗疼痛的药效物质基础与分子作用机制［J］.康复学报，2016，26（1）：33-37.

［9］ 谢新宇，梅阳阳，付长龙，等.乌头汤对脂多糖诱导大鼠软骨细胞炎症反应的影响［J］.风湿病与关节炎，2020，9（3）：1-5，11.

［10］ KHOJAH HM，AHMED S，ABDEL-RAHMAN MS，et al.Reactive oxygen and nitrogen species in patients with rheumatoid arthritis as potential biomarkers for disease activity and the role of antioxidants［J］.Free Radic Biol Med，2016，97（1）：285-291.

［11］ 付长龙，梅阳阳，李民，等.狗脊多糖对硝普钠诱导退变大鼠软骨细胞氧自由基影响的研究［J］.风湿病与关节炎，2018，7（6）：5-9，14.

［12］ 欧阳龙强，夏文燕，杨少春，等.大黄素对海人酸致痫小鼠海马iNOS和COX-2表达的影响［J］.中国当代医药，2018，25（2）：11-14.

［13］ WEI B，ZHANG Y，TANG L，et al.Protective effects of quercetin against inflammation and oxidative stress in a rabbit model of knee osteoarthritis［J］.Drug Dev Res，2019，80（3）：360-367.

［14］ 洪振强，高弘建，苏友新，等.马钱子总碱对兔膝骨关节炎模型软骨损伤修复作用及机制［J］.中国中西医结合杂志，2018，38（8）：991-996.

［15］ 张昊悦，赵蓓，王业皇，等.大黄素通过调节Nrf2/HO-1和MAPKs抑制炎症和氧化应激机制研究［J］.中国免疫学杂志，2021，37（9）：1063-1068.

［16］ ANSARI MY，AHMAD N，HAQQI TM.Oxidative stress and inflammation in osteoarthritis pathogenesis：role of polyphenols［J］.Biomed Pharmacother，2020，129（1）：110452.

［17］ LU MC，JI JA，JIANG ZY，et al.The Keap1-Nrf2-ARE pathway as a potential preventive and therape-utic target：an update［J］.Med Res Rev，2016，36（5）：924-963.

［18］ 付长龙，梅阳阳，叶锦霞，等.乌头汤治疗寒湿痹阻型膝骨关节炎：与双氯芬酸钠的比较［J］.风湿病与关节炎，2017，6（4）：12-16.