赵丽辉 孙世珺★ 易冰 曾玉梅

甲状腺癌是内分泌器官最常见的恶性肿瘤，其发病率逐年增高，不同组织学类型和亚型的甲状腺癌具有不同的细胞来源、肿瘤特征和预后。其中甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）最常见，约占甲状腺癌的85%～90%［1-2］。BRAF基因在多种恶性肿瘤中发生突变，研究证实，V600E 是BRAF突变最常见的突变位点，在PTC 中BRAFV600E 突变的发生率为40%～80%［3-5］。研究显示BRAFV600E 与PTC 不良临床病理结果有很强的相关性，如复发增加［6］、对放射性碘的摄取减弱及治疗失败等［7-8］。PTC 原发灶的BRAFV600E 基因突变与远处转移灶的摄碘能力下降有关［9］。甲状腺细针穿刺细胞学检查（fine needle aspiration cytology，FNAC）可在术前明确甲状腺结节性质，为甲状腺疾病个体化精准治疗提供依据，是甲状腺诊治决策的关键，近几年在广东省甲状腺肿瘤患者诊断中的运用较为广泛。本研究探讨BRAF基因突变在PTC早期诊断、治疗策略选择及预后判断中的意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料

分析自2017年11月至2020年10月于中山市人民医院就诊的甲状腺结节患者601 例，均在B 超引导下行细针穿刺（FNA），穿刺新鲜细胞液给予细胞学诊断及BRAF基因检测，检测后保守治疗344 例，手术治疗257 例，手术后病理结果确诊为恶性肿瘤212例，其中PTC 患者208 例，男性44 例，女性164 例，年龄平均（42.03±10.21）岁，甲状腺滤泡性癌患者2 例，甲状腺髓样癌2例。良性病变45例，其中结节性甲状腺肿40 例，滤泡腺瘤2 例，桥本甲状腺炎2 例，透明变梁状肿瘤1 例。纳入标准：①术前有彩超记录且评估结节为可疑恶性（TI-RAS 分类4 类及以上结节）；②术前行FNA 及穿刺液BRAF基因检测；③行甲状腺手术治疗；④术后病理明确。排除标准：①多次手术患者；②非本院行FNA 及BRAF基因检测；③病历资料不完整。所有患者穿刺及术前均签署知情同意书。本研究经过院伦理委员会批准同意。

1.2 试剂和方法

601 例甲状腺结节患者均行BRAFV600E 基因检测，检测试剂为人类BRAF基因V600E 突变检测试剂盒（厂家：厦门艾德生物医药科技有限公司；批号：11220070701X；规格：24 人份/盒），用于BRAF基因V600E 体细胞突变（即1799T＞A）检测。PCR 使用扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）法，RT-PCR 仪为上海宏石荧光定量PCR 仪（规格型号：SLAN-96S）。临床医师在超声引导下，定位穿刺结节，用细针准确进行穿刺后，将穿刺出的新鲜细胞液一针注入液基保存瓶编号标记后送往病理科进行液基细胞学诊断，另一针注入预装有200 μL DTL 裂解液的1.5 mL 离心管中，编号标记后送往分子诊断中心进行BRAF基因检测。标本保存在4℃，不超过72 h。核酸提取采用FFPE DNA 核酸提取试剂（厦门艾德生物医药科技有限公司），并使用超微量紫外分光光度仪进行质控及浓度测定。PCR 上机时将样品浓度稀释至1 μg/L，浓度不足1 μg/L 的标本，DNA 按原浓度上机。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0 统计软件进行统计分析；计数资料以n（%）表示，行卡方检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲状腺结节术后患者BRAF V600E 基因突变情况

257 例患者中，术后病理结果确诊为PTC 208例，BRAFV600E 基因突变型137 例，突变率为65.87%（137/208），野生型71 例，占34.13（71/208），甲状腺其他类型癌（甲状腺滤泡癌2 例，甲状腺髓样癌2 例）及甲状腺良性病变（结节性甲状腺肿40 例，滤泡腺瘤2 例，桥本甲状腺炎2 例，透明变梁状肿瘤1 例）均未检测到BRAFV600E 基因突变，甲状腺结节中，PTC 与其它癌变及良性病变BRAFV600E 基因突变比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 甲状腺结节术后患者BRAF 基因突变的比较［n（%）］Table 1 Comparison of BRAF gene mutations in patients after thyroid nodule surgery［n（%）］

2.2 BRAF V600E 基因检测与液基细胞学诊断结果

术后病理结果确诊为恶性肿瘤的212 例中，BRAFV600E 基因突变阳性208 例（均为PTC），突变阴性4 例；术前FNAC 细胞学诊断结果为恶性肿瘤108 例，可疑恶性肿瘤76 例，滤泡性肿瘤2 例，非典型病变21 例，良性病变4 例，无法诊断1 例，病理结果为甲状腺良性病变45 例，均为BRAFV600E 阴性，术前FNAC 细胞学诊断结果可疑恶性肿瘤19例，滤泡性肿瘤1 例，非典型病变11 例，良性病变12 例，无法诊断2 例。在病理确诊的212 例甲状腺癌中，FNAC 诊断为恶性肿瘤108 例，敏感性50.94%（108/212）；BRAFV600E 基因检测突变阳性137 例，敏 感 性64.62%（137/212），FNAC+BRAFV600E 两种诊断方法联合检测敏感性83.02%（176/212），联合检测使诊断的检出率明显提高。见表2。

表2 BRAF V600E基因检测与液基细胞学（FNAC）诊断结果Table 2 BRAF V600E gene testing and fluid based cytology（FNAC）diagnosis results

2.3 甲状腺乳头状癌BRAF V600E 基因突变状态与患者临床病理特征的关系

PTC 伴有钙化灶患者BRAFV600E 基因突变率明显高于PTC 不伴有钙化灶患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。PTC 不伴有结节性甲状腺肿的患者BRAFV600E 基因突变率明显高于PTC 伴有结节性甲状腺肿患者，差异有统计学意义（P＜0.05），肿瘤最大直径＜1.0 cm 的PTC 患者BRAFV600E 基因突变率明显高于最大直径≥1.0 cm 的PTC 患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期的PTC 患者BRAFV600E 基因突变率明显高于Ⅰ～Ⅱ期的PTC 患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 甲状腺乳头状癌BRAF 基因突变与临床病理特征的关系［n（%）］Table 3 Relationship between BRAF gene mutation and clinicopathological features in papillary thyroid carcinoma［n（%）］

3 讨论

超声引导下的细针穿刺（fine-needle aspiration，FNA）是甲状腺结节良恶性甄别的首选方法［10］，2017 版Bethesda 系统（TBSRTC），将甲状腺细针穿刺后的病理学结果分为六类，并对每种分类提供了恶性风险判断与临床处理原则［11］。但细胞形态学的观察范围有限，仍有占比较大的Ⅲ至Ⅴ类结果不能定性。中国甲状腺癌诊疗规范（2018年版）认为，经FNA 不能确定良恶性的甲状腺结节，可对穿刺标本进行某些甲状腺癌的分子标记物检测［10］BRAF基因是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK信号通路最为关键的激活因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等［12］。BRAF突变主要有两种类型：发生于exon11 上的甘氨酸环，如G463、G465、G468等的点突变；发生在Exon15激活区，其中约90%位于第1 799 核苷酸上，T突变为A（T1799A），导致其编码的缬氨酸由谷氨酸取代。BRAFV600E 突变检测在甲状腺术前治疗决策的影响不容忽视，突变状态不仅可以提高细胞学恶性结节的诊断率，也为难治性甲状腺癌的靶向药物BRAFV600E 抑制剂（如威罗菲尼）治疗提供病理依据［13］。研究显示，BRAF基因在PTC 中的突变率可达60%～80%，在亚洲人群中，BRAF突变率甚至更高，BRAF在FTC 中较少突变，在良性结节罕见突变［14］。术前检测BRAFV600E突变状况，有助于PTC 的诊断和临床预后预测，便于制定个体化的诊治方案［10］。

本研究结果与既往研究报道数据基本相符，提示BRAFV600E 基因突变与PTC 密切相关。

Brown 等［15］研究认为，BRAF 基因检测联合FNA 细胞学检查大幅提高了穿刺的敏感度。本研究结果显示联合检测使诊断的敏感性由50.94%提高到83.02%，明显提高了甲状腺恶性结节的检出率，因此，联合FNAC 及BRAFV600E 基因突变检测有助于PTC 的早期诊断。研究报道，BRAF基因突变假阳性非常低，FNA 细胞标本伴BRAF 突变可以高度怀疑恶性结节［10］。在本次研究中，发现一例患者BRAFV600E 基因突变阳性，但术后病理结果为结节性甲状腺肿，经再次广泛取材，重新病检结果为甲状腺微小乳头状癌。因此，BRAFV600E 基因检测结果对病理组织漏检也有一定帮助。

Changlin Li 的最新报道证实，肿瘤组织钙化与PTC 的侵袭性呈正相关［16］。本研究结果提示BRAF基因突变更易发生在肿瘤直径小于1cm 的PTC 中，在伴有钙化、不伴结节性甲状腺肿、临床分期较高的甲状腺乳头状癌BRAFV600E 基因突变率较高。慢性淋巴细胞性甲状腺炎（chroniclymphocytic thyroiditis，CLT）又称伴桥本氏甲状腺炎，是原发性甲状腺功能减退症最主要的原因。Ju-Han Lee 等［17］基于10648 例PTC 患者的荟萃分析显示，PTC 与CLT 显著相关，CLT 的合并率为23.2%，比合并良性甲状腺结节性疾病高2.8 倍。本研究中，甲状腺乳头状癌合并CLT 的比例为11.5%，低于文献报道，但在两组间BRAF基因突变率无明显差异。因此，PTC 患者BRAFV600E 基因突变状态与是否伴有钙化灶、是否伴有结节性甲状腺肿及肿瘤最大径、TNM 分期相关，在伴有钙化、肿瘤最大径小于1.0 cm、不伴结节性甲状腺肿、临床分期较高的甲状腺乳头状癌中BRAFV600E 基因突变率较高。BRAFV600E 基因突变状态与PTC 患者年龄、性别、病理亚型、肿瘤穿刺部位、慢性淋巴细胞性甲状腺炎等无明显相关。

综上所述，本组研究中山市地区甲状腺癌患者BRAFV600E 基因突变主要发生在甲状腺乳头状癌患者中，其它组织学类型的甲状腺癌BRAFV600E 基因突变率较低，PTC 患者女性发病率高于男性。BRAFV600E 基因突变更易发生在肿瘤直径小于1 cm 的PTC 中，在伴有钙化灶、不伴结节性甲状腺肿、临床分期较高的PTC 中BRAF基因突变率越高，预后越差。BRAFV600E 基因检测结果对防止病理组织漏检也有一定帮助，尤其是微小癌。联合FNAC 及BRAF基因的检测有助于PTC 的早期发现、早期诊治和预后判断。