文火月，林伟雄，肖 璇，陈 萍△

（1.广西医科大学第一附属医院儿科；2.国家卫生健康委地中海贫血防治重点实验室；3.中国医学科学院地中海贫血防治研究重点实验室；4.广西医科大学地中海贫血防治重点实验室，南宁 530021）

β-地中海贫血是一种由β-珠蛋白基因突变或缺失导致β-珠蛋白合成障碍的单基因遗传病，在我国南方地区具有较高的基因携带率，其中尤以两广地区为重[1]。通常情况下，单个β-珠蛋白等位基因突变即突变的杂合子不会出现临床症状，突变的纯合子或双重杂合子才会出现明显的临床症状[2]。血液学检查和血红蛋白分析是识别地中海贫血携带者的基础，分子诊断对于明确地中海贫血诊断和预测疾病的严重程度起到重要的作用，对实施地中海贫血的治疗和预防具有重要意义[3]。目前国内外已发现的β-珠蛋白基因突变类型有400多种，而外显子3区域的突变较少[4]。本研究报道1 例罕见的β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG，HBB：c.344T＞C）突变导致β-地中海贫血的血液学特点和临床特征。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2021年1～12月就诊于广西医科大学第一附属医院并且地中海贫血筛查提示β-地中海贫血的病例共440例。

1.2 血常规检查 用EDTA-K2抗凝采血管采集患者外周静脉血，通过血细胞自动分析仪（CELLDYN1700，Abbott，美国）及配套试剂检测患者的血红蛋白含量（Hb）、红细胞平均体积（MCV）、红细胞平均血红蛋白量（MCH）、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）、血红细胞（RBC）计数和红细胞比容（HCT）等血常规检测指标。

1.3 血红蛋白分析 应用血红蛋白分析仪（HbVaruantⅡ，Bio-Rad，美国）进行Hb分析，检测Hb组分如Hb A、Hb A2、Hb F和异常血红蛋白。

1.4 DNA提取 采用Lad-Aid 820核酸提取仪及仪器配套核酸提取Midi 试剂提取血样本的基因组DNA（厦门致善生物科技有限公司），用微量紫外分光光度计（Nanodrop 2000，Thermo Fisher Scientific，美国）检测提取到的基因组DNA的浓度和纯度。

1.5 β-地中海贫血基因突变分析

1.5.1 β-珠蛋白基因21 个位点的21 种突变类型定性检测 采用基于荧光PCR 熔解曲线法的β-地中海贫血基因检测试剂盒（厦门致善生物科技有限公司）检测21 种β-地中海贫血突变（包括IVS-Ⅱ-654 M、-28 M、-29 M、14-15 M、15-16 M、17 M、41-42 M、26 M、27-28 M、30 M、37 M、43 M、71-72 M、IVS-2 M M、IVS-2 M M、IVS-2 M M、-30 M、-31 M、-32 M、-73 M、-90 M）。根据试剂盒说明书进行操作。

1.5.2 β-珠蛋白基因测序 设计引物上游引物：5’-TACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTG-3’，下游引物：5’-ATGGTAGCTGGATTGTAGCTG-3’（引物由上海生工生物工程股份有限公司合成）。使用PCR扩增仪（Gene-Amp9700，Thermo Fisher Scientific，美国）扩增DNA样本目的片段。PCR扩增采用宝日医生物技术（北京）有限公司提供的TaKaRa LA Taq酶和2×GC Buffer。扩增体系50 μL：含2×GC Buffer 25 μL，dNTP 8 μL，待测DNA样本（100 ng/gL）3 μL，15 pmol/μL 的上游和下游引物各1 μL，LA Taq 酶0.3 μL，去离子水11.7 μL。反应条件：94 ℃5 min，94 ℃60 s、58 ℃60 s、72 ℃120 s，共35 个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR 扩增产物送华大基因公司进行β-珠蛋白基因测序。

1.6 α-地中海贫血基因分析

1.6.1 4种缺失型α-地中海贫血突变基因型检测

采用基于Gap-PCR 方法的缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒（深圳市亿立方生物技术有限公司），检测α-地中海贫血4 种缺失型突变基因型：-α4.2，-α3.7，--SEA，--THAI。

1.6.2 3种非缺失型α-地中海贫血突变基因型检测

采用基于荧光PCR 熔解曲线法的非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒（厦门致善生物科技有限公司），检测α-地中海贫血3种点突变基因型：Hb CS、Hb QS和Hb WS。

2 结果

2.1 一般资料 440 例β-地中海贫血杂合子病例中，男性185 例，年龄范围10 个月至83 岁，女性255例，年龄范围7 个月至79 岁。从440 例β-地中海贫血病例中检出1 例罕见的β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG）突变杂合子。该病例为女性，29 岁，面色较苍白，皮肤巩膜无黄疸，无出血点，无肝脾肿大，无输血史，既往血清铁蛋白检查结果为429.87 ng/mL。

2.2 血常规结果 1例β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG）杂合子突变病例的血常规结果：Hb 78.3 g/L，RBC 3.65×1012/L，MCV 66.52 fL，MCH 21.48 pg，MCHC 322.9 g/L及HCT 0.243。提示患者有中度贫血。其他439例单纯β-地中海贫血杂合子的血常规结果：Hb（115.2±12.46）g/L，RBC（5.79±0.68）×1012/L，MCV（64.27±5.48）fL，MCH（20.10±1.94）pg，MCHC（312.58±8.41）g/L及HCT（0.37±0.03）。进一步对439例β-地中海贫血杂合子病例中不同性别患者的血常规分析结果进行比较，见表1。

表1 β-地中海贫血杂合子病例中不同性别患者血常规分析结果比较

2.3 血红蛋白分析结果 β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG）杂合子突变病例血红蛋白分析结果：Hb A24.4%，Hb F 2.6%，未见异常血红蛋白。

2.4 β-地中海贫血基因分析结果

2.4.1 β-地中海贫血突变基因型检测 患者未检测到21种β-地中海贫血突变基因型。

2.4.2 基因测序结果患者基因测序 结果表明，在β-珠蛋白基因第114 位密码子处检测到T＞C 杂合突变，即CTG＞CCG突变（图1），根据人类基因组变异学会（HGVS）命名规则命名为HBB：c.344T＞C。

图1 β-珠蛋白基因测序序列图

2.5 α-地中海贫血基因检测结果

2.5.1 缺失型α-地中海贫血试剂盒检测 结果患者未检出试剂盒范围内的4种缺失型α-地中海贫血基因型。

2.5.2 非缺失型α-地中海贫血试剂盒检测 患者未检出试剂盒范围内的3种非缺失型α-地中海贫血基因型。

3 讨论

目前国内外已报道β-珠蛋白基因突变类型有400多种（HbVar数据库），国内已报道β-珠蛋白基因点突变129种[5]，其中CD41-42、CD17、IVS-Ⅱ-654、-28、CD71-72、CD26、IVS-Ⅰ-1、-29 这8 种突变就占据了中国人群β-地中海贫血突变总体的绝大部分[6]。β-珠蛋白基因外显子3区域突变相对较少，国内外显子3 区域突变报道罕见，已报道的如CD112（TGT＞TGA）（HBB:c.339T＞A）[7]和CD121（GAA＞TAA）（HBB:c.364G＞T）[8]基因突变，均为单个病例报道。

β-珠蛋白基因不同位点发生的突变对β-珠蛋白基因功能的影响不同。β-珠蛋白基因外显子3区域为基因的编码区，该区域的突变可能影响RNA 翻译，从而干扰了β-珠蛋白基因的功能，合成异常的β-珠蛋白链。外显子3的CD114（CTG＞CCG）突变使该位点编码的亮氨酸被脯氨酸替换，该突变位于G-螺旋中，可能会对G-螺旋中用于血红蛋白初始二聚体的形成和血红蛋白四聚体的组装的α1β1接触点产生负面干扰。由此产生的未结合的异常β-珠蛋白链伴随过剩的α-珠蛋白链沉淀于红细胞内，使红细胞内蛋白水解机制超载，造成无效的红细胞生成，最终导致β-地中海贫血[9]。

β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG）杂合子突变最先于意大利人群中发现[10]，患者为1例14岁儿童，是该突变与（ααα/αα）三联体形成的复合杂合子，中度贫血（Hb 75 g/L，MCV 71 fL，MCH 20.3 pg），Hb分析显示：Hb A23.2%，Hb F 16%。患者1岁左右开始出现贫血，最初分别在3岁和5岁时输血1次，7岁以后每月输血1次，表现为中间型β-地中海贫血。

其它文献报道的CD114（CTG＞CCG）杂合子突变导致地中海贫血病例大部分为中度贫血，如见于爱尔兰裔美国白人[11]、韩国[12]、日本[13]、智利的西班牙裔[14]的4例CD114（CTG＞CCG）杂合子突变病例，均为中度贫血（Hb 74～86 g/L），Hb 分析显示Hb A2升高（3.3%～7.0%），1例病例Hb F为＜0.5%，其余病例Hb F为3.0%～7.5%。其中西班牙裔病例为1 例40 岁男性，从7 岁开始需要每6 周输注两个单位红细胞以维持Hb水平在80～85 g/L，被诊断为中间型β-地中海贫血。Curur 等[15]报道的2 个俄罗斯家系6 例CD114（CTG＞CCG）杂合子病例，Hb 60～125 g/L，Hb 分析显示Hb A24.0%～5.0%，Hb F 1.0%～14.7%。

CD114（CTG＞CCG）合并其它β-珠蛋白基因突变病例也有报道。Cannata 等[9]报道1 例CD114（CTG＞CCG）与IVS-Ⅰ-110（G＞A）的双重杂合子，患者为10个月大的意大利女婴，重度贫血（Hb 35 g/L，MCV 63.2 fL，MCH 19.6 pg），脾脏和肝脏肿大，表现为典型的重型β-地中海贫血。

至目前国内未见CD 114（CTG＞CCG）突变病例报道。本研究在广西人群中发现1 例CD114（CTG＞CCG）突变杂合子病例，患者血常规检测显示：RBC 3.65×1012/L，Hb 78.3 g/L，Hb 分析有Hb A2升高，为4.4%。患者临床表现为中度贫血，无脾肿大和输血史，未合并其它α-和β-地中海贫血基因突变。本病例与上述报道的大多数杂合子突变病例相似，有中度贫血，Hb A2升高。

单纯β-珠蛋白基因突变杂合子病例临床上一般无症状或有轻度贫血，通常表现为轻型β-地中海贫血[16]。本研究中除CD114（CTG＞CCG）突变杂合子病例外的439例β-地中海贫血杂合子病例表现为轻度贫血或无贫血。其中男性病例Hb、RBC 均值分别为122.06 g/L 和6.17×1012/L，较女性病例高，分析其原因，在正常生理情况下，男性的Hb、RBC 等的数值均高于女性。此外，439 例β-地中海贫血杂合子病例的MCV、MCH等均降低，这些改变符合β-地中海贫血的血液学特征。而男性病例MCV、MCH较女性病例低，造成这种差异的原因还需要更多病例做进一步分析。

本文和国外报道的CD114（CTG＞CCG）杂合子病例表现为中度贫血。其可能机制为此突变可产生异常β-珠蛋白，异常β-珠蛋白伴随过剩α-珠蛋白链的降解会给红细胞前体的蛋白水解过程添加额外负担，导致更严重的无效红细胞生成[12]，从而导致较严重的临床表型。但因为病例数较少，仍需发现更多的病例做进一步的研究，以便更全面了解该基因突变类型的血液学特点及临床特征。

当CD114（CTG＞CCG）合并β-珠蛋白基因IVS-Ⅰ-110（G＞A）突变时，由于IVS-Ⅰ-110（G＞A）突变可引起异常剪接mRNA的产生，两种突变之间可能存在协同效应，从而引起更严重的β-地中海贫血表型[9]。当CD114（CTG＞CCG）合并α-珠蛋白基因三联体时，患者严重的临床表现可能与α-珠蛋白肽链产量增加进一步加剧了α-珠蛋白肽链的过剩有关[16]。

β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG）突变在国内外都较为罕见，其杂合子在临床上可表现为中度贫血，部分病例需要输血等相应治疗。这些特征与其它大多数单纯β-珠蛋白基因杂合子突变仅导致无症状或有轻度贫血不同[17]，值得我们重视，特别在临床诊疗、遗传咨询和产前诊断中要加以注意，避免漏诊和误诊，导致延误治疗。