陈星宇，卢创宏，吴晓丹，曾志羽△

（1.广西医科大学第一附属医院心内科，南宁 530021；2.广西心脑血管疾病防治精准医学重点实验室，南宁 530021；3.广西心脑血管疾病临床医学研究中心，南宁 530021）

风湿性心脏病（rheumatic heart disease，RHD）是指由于风湿热活动，累及心脏瓣膜而造成的心脏病变，在低、中等收入国家及高收入国家贫困地区人群中高度流行[1]。目前我国仍有250 万RHD 患者[2]。风湿热患者咽喉部被A 组链球菌反复感染，或者某些易感人群因皮肤链球菌感染从而导致机体异常免疫反应[3]，50%～75%的患者会进展为RHD[4-5]，出现心律失常、心力衰竭等并发症及永久性心脏瓣膜损伤[6-7]。自身免疫性和炎症在瓣膜损伤中起着重要作用，但其分子机制尚未完全清楚[8]。对于晚期RHD患者，经皮或手术换瓣后可明显改善预后，然而在疾病流行率最高的欠发达地区，换瓣手术受到了技术水平和社会经济条件的双重限制。

随着测序技术的飞速发展，高通量测序（nextgeneration sequencing，NGS）技术已经被广泛用于各种疾病中，有助于深入了解疾病发生的分子机制及其调控网络。非RHD瓣膜病瓣膜标本较难收集，且目前没有关于RHD瓣膜转录组的测序研究，仅有对RHD血清进行测序的基因组研究[9]。因此，本课题组通过NGS 对8 例RHD 患者的瓣膜组织和非RHD 患者的瓣膜组织进行mRNA 测序，探索RHD瓣膜损伤的分子机制，为RHD患者瓣膜病变的治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年1月至2021年12月在广西医科大学第一附属医院行二尖瓣置换术（mitral valve replacement，MVR）患者的瓣膜组织，其中RHD 患者（RHD 组）23 例，非RHD 患者（Con 组）10例。两组性别、年龄、体重指数、血糖及心功能指标比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），具有可比性。RHD 组纳入标准：病例资料完整，通过心脏彩色多普勒超声检查确定是二尖瓣狭窄为主，结合临床表现和术后病理检查，确诊为RHD。Con组纳入标准：因其他原因导致需进行MVR 手术的患者。两组均排除年龄＜18岁，或合并感染性心内膜炎、自身免疫性疾病、肿瘤、心肌病、高血压、糖尿病等患者。本研究已取得医院伦理委员会批准。所有患者及其家属均已签署知情同意书。

1.2 基因测序 用Illumina HiSeq 测序仪进行测序，获得原始数据。使用StringTie软件计算并检测两组样本的差异mRNA 表达并进行数据分析。再用DEseq2 软件分析两组间差异基因表达，对差异基因进行基因功能（GO）分析和京都基因与基因百科全书（KEGG）富集分析，并通过蛋白相互作用网络（PPI）筛选出关键基因。

1.3 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证关键基因表达 取两组瓣膜组织，提取组织RNA，使用Nanodrop 2000 检测RNA 浓度和纯度，逆转录为cDNA，行PCR 扩增。RT-qPCR 反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火、延伸30 s，共40 个循环。采用2-△△CT法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列（5’～3’）

1.4 统计学方法 使用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，偏态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）[M（P25～P75）]表示，组间比较采用非参数检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异基因表达 两组间共有4 498个差异表达基因，其中上调2 315 个，下调2 183 个。显著差异表达530个（表2），设置P＜0.05且｜log2Fold Change|＞1.5，绘制火山图（图1）。

图1 差异基因火山图

表2 两组瓣膜组织的差异mRNA表达

2.2 聚类分析 通过绘制热图（图2）显示两组间差异mRNA的相关性，颜色深浅表示基因表达量的高低。两组间显著差异的mRNA在本组基本聚集，表明差异mRNA 表达趋势在两组间差异有统计学意义。

图2 两组瓣膜组织中显著差异基因的分层聚类热图

2.3 GO功能富集分析结果 主要富集的生物学过程（BP）为细胞外基质（ECM）和结构的组装和分解，主要的细胞成分（CC）为细胞外基质，显著的分子功能（MF）为钙黏着蛋白结合和肌动蛋白结合，见图3。

图3 GO功能富集分析结果

2.4 KEGG分析 通过对530个显著差异基因进行KEGG富集分析并绘制气泡图，结果显示：差异基因主要富集于细胞基质黏着、白细胞跨内皮转移、ECM 受体相互作用等信号通路中，见图4。

图4 KEGG富集气泡图

2.5 PPI 分析结果 将530 个显著差异基因使用String 数据库进行数据分析得到PPI 图（图5），然后将PPI导入Cytoscape得到差异基因节点排序（图6）。结合以往的研究和文献，本组筛选了3 个关键基因进行RT-qPCR验证。

图5 基于显著差异基因的PPI图

图6 PPI图中关键基因节点数量的排序

2.6 RT-qCR验证结果 与Con组比较，FN1、CD44、VCAM-1在RHD组瓣膜组织中的表达均上调，见表3。

表3 两组FN1、CD44、VCAM-1 mRNA表达水平比较

3 讨论

本研究通过NGS 在RHD 患者与非RHD 患者中共筛选出530个显著差异表达基因，其中上调326个，下调204个；通过KEGG分析得出其主要富集在细胞基质黏着、白细胞跨内皮转移、ECM 受体相互作用等信号通路中，并且筛选出FN1、CD44、VCAM-13个关键基因，经RT-qPCR验证为RHD瓣膜病变相关基因。

研究表明，心脏ECM 重构与心肌纤维化有关，ECM 也是治疗心肌病变的一个潜在靶点[10]。且ECM受体相互作用在心脏重塑中起着重要的作用，ECM 蛋白的积累可导致心脏功能恶化[11]。本研究通过测序发现，ECM 受体相互作用信号通路在RHD中被大量富集。纤连蛋白（FN）是存在于动物细胞表面的细胞外大分子膜蛋白，是ECM和基底膜中的主要非胶原糖蛋白[12]。FN1 作为一种多功能ECM 蛋白分子，在细胞黏附中发挥重要的作用，也是ECM 受体相互作用和细胞基质黏着通路的主要信号分子，参与多种细胞生物学过程，并在纤维化疾病中发挥作用[13]。有研究显示，纤维化蛋白FN1表达上调可加重肾脏纤维化，靶向调控FN1表达能减轻膀胱纤维化[14-15]。在RHD患者瓣膜中，ECM的大量沉积及FN1 的高表达与瓣膜纤维化高度相关。因此，ECM 及其相关通路在RHD 病变中发挥重要作用。本研究结果显示，RHD患者瓣膜组织中FN1表达上调。

此外，CD44 也是一种广泛表达的ECM 成分主要受体，在炎症和血管损伤中起着重要作用[16]。心肌炎症损伤时实质细胞和造血细胞CD44 表达上调。在哮喘和动脉粥样硬化中，CD44 被证明在炎症部位调节白细胞，包括巨噬菌体、T细胞和嗜酸性粒细胞[17]。CD44受体是透明质酸（HA），HA受多种细胞因子的调节，包括炎性细胞因子[18]。研究表明，HA 分解代谢通过CD44、HYAL-1 和HYAL-2 介导酶。炎症部位的LMWHA 片段介导炎症效应并刺激心脏成纤维细胞和肌成纤维细胞增殖，通过与CD44相互作用导致组织纤维化[19]。CD44与HA之间的相互作用会触发细胞内信号传导促进瓣膜纤维化，也会导致心脏重构。本研究发现，CD44在RHD患者瓣膜组织中的表达上调。

VCAM-1是一种90 kDa的糖蛋白，主要表达于内皮细胞[20]，在白细胞跨内皮转移通路中有着重要作用。白细胞上表达的A4P1整合素黏附在内皮细胞表面VCAM-1 上，激活内皮细胞的信号通路，从而导致白细胞的跨内皮细胞转移[21]。研究显示，在RHD 患者血清中VCAM-1 水平升高[22]。本研究RHD 患者瓣膜组织VCAM-1表达上调。表明内皮细胞被激活，进而使其更容易被免疫系统攻击，从而导致瓣膜持续免疫反应，引起组织损伤。

综上所述，FN1、CD44、VCAM-1基因在RHD瓣膜病变中的表达上调，可能在ECM受体相互作用和白细胞跨内皮转移等信号通路中发挥重要作用。