张潇剑，蓝 利,2，阙 婷，唐立博，杨子叶，唐 深,2△，罗小玲△

（1.广西医科大学基础医学院，南宁 530021；2.广西高校基础医学研究重点实验室，南宁 530021）

绿原酸（chlorogenic acid，CGA）是一种含有奎宁酸和咖啡酸的缩酚酸，在咖啡、金银花、绿茶中的含量极为丰富[1]，具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗肿瘤等作用[2-3]。近年来有关天然化合物对肿瘤的治疗作用研究越来越多。有研究表明，CGA可通过上调人肺腺癌A549 细胞抗氧化酶表达，降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）介导的c-Jun NH2 末端激酶、p38激酶和MAPK激酶4的磷酸化，抑制癌细胞增殖[4]。此外，CGA 可增加小鼠脾脏中CD4+T细胞和CD8+T 细胞的比例，减缓乳腺癌生长，提高存活率，并能抑制癌细胞的肺转移[5]。

原发性肝癌是全球第七大常见的癌症，是仅次于肺癌的全球第二大致死率的恶性肿瘤，在病因学和生物学上具有异质性，其中肝细胞癌（HCC）是最常见的组织学亚型[6]。肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）由肿瘤细胞、多种免疫细胞和基质细胞组成，是实体肿瘤发生和发展依赖的特殊组织结构[7-8]。肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAM）在TME的组成中占有重要地位，可占某些TME细胞数量的50%以上。TAM按照功能通常分为两类，即经典激活途径的M1 与交替激活途径的M2，M1 和M2 通过相互转化产生抗肿瘤或促进肿瘤发展两种相反的作用[9-11]。有文献报道，M2样TAM与肝癌的不良预后密切相关[12]。近年来TME中M1与M2型巨噬细胞的极化稳态平衡规律是肿瘤研究的热点，对肿瘤预后有重要的意义。本研究通过诱导人急性单核白血病细胞THP-1 分化为M0型巨噬细胞，利用Transwell细胞共培养技术，构建HCC 细胞HepG2 与M0 共培养体系诱导TAM的生成，初步研究CGA 对肝癌相关TAM 极化的干预作用。

1 材料与方法

1.1 材料

THP-1细胞、HepG2细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。CGA（美国Sigma公司），佛波酯（PMA，美国Sigma 公司），青霉素、链霉素（索莱宝生物技术公司），RPMI 1640培养液、MEM培养液、胎牛血清（美国Gibco公司），Transwell细胞培养板（美国Corning 公司），RNA 逆转录相关试剂、TRIzol（日本TaKaRa公司），SYBR Green Master（美国Roche 公司），引物由Invitrogen 公司合成。StepOne 荧光定量PCR 仪、CO2细胞培养箱均为美国Thermo Fisher Scientific产品。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 THP-1 细胞和HepG2 细胞分别培养于含10%的胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的RPMI 1640 培养液和MEM 培养液中，37 ℃、5%CO2培养箱中静置培养。

1.2.2 HepG2与M0共培养 THP-1细胞以3.5×105个/孔接种于12 孔板Transwell 下室，经100 mmol/L PMA 刺激48 h 后，细胞贴壁展开活化为M0 型巨噬细胞[13]。HepG2细胞以1.8×105个/孔接种于12孔板Transwell 上室，与M0 共培养诱导TAM，分为4 组：M0组、TAM组、TAM+50 μg/mL CGA组、TAM+100 μg/mL CGA组。

1.2.3 细胞形态观察 倒置显微镜下观察各组细胞形态学变化、拍照。Image J 软件分析各组圆形/类圆形细胞、长梭形细胞的数量，并计算圆形/类圆形细胞数和长梭形细胞数占总细胞数的百分比。

1.2.4 CCK-8 法检测TAM 样巨噬细胞活性 用PBS 清洗细胞，加入40 μL CCK-8（20 μg/mL）和400 μL RPMI 1640细胞培养液，置于37 ℃细胞培养箱中培养2 h，采用全波长分光光度计检测450 nm波长处的吸光度（A）值。细胞存活率=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100%。As：实验孔（含有CGA和细胞的培养基）；Ac：对照组（含有细胞的培养基）；Ab：空白孔（仅有培养基）。

1.2.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测巨噬细胞极化相关标志物mRNA 表达 用TRIzol 提取细胞总mRNA，逆转录为cDNA，行PCR 扩增，PCR 反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火、延伸10 s，共40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。β-actin上游引物序列：5’-TCCTCTCCCAAGTC-CACACAGG-3’，下游：5’-GGGCACGAAGGCTCATCATTC-3’；白介素（IL）-6上游：5’-ACTCACCT-CTTCAGAACGAATTG-3’，下游：5’-CCATCTTTG-GAAGGTTCAGGTTG-3’；IL-10上游：5’-TCAAGGCGCATGTGAACTCC-3’，下游：5’-GATGTCAAACTCACTCATGGCT-3’；CD163上游：CAGCGGCTTGCAGTTTCCTC-3’，下游：5’-TGGCCTCCTTTTCCATTCCAGA-3’；环氧化酶2（COX-2）上游：5’-GCCATGGGGTGGACTTAAATCATA；下游：CAGGGACTTGAGGAGGGTAGATCA-3’。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HepG2与M0巨噬细胞共培养后的形态学改变

THP-1 细胞经PMA 刺激活化为M0 巨噬细胞，细胞由悬浮的球形逐渐贴壁，并转变为圆形或类圆形贴壁细胞，并由透亮变为暗灰；与HepG2 共培养后M0极化为TAM样巨噬细胞，呈圆形/类圆形或梭形，随着共培养时间的延长，不规则细胞（b、c）数量增加；共培养72 h后TAM细胞内出现空泡，部分细胞死亡，见图1。

图1 HepG2诱导TAM样巨噬细胞形态学观察（×20）

2.2 共培养时间对TAM样巨噬细胞细胞活性的影响

M0 巨噬细胞与HepG2 细胞共培养24 h、48 h，随着共培养时间延长，细胞存活率升高，共培养72 h后细胞存活率降低，见图2。因此，选择48 h作为后续实验的共培养时间。

图2 共培养时间对TAM样巨噬细胞存活率的影响

2.3 不同浓度CGA 对TAM 样巨噬细胞活性的影响

分别用25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和200 μg/mL CGA 干预HepG2 诱导的TAM，共培养48 h，在25～100 μg/mL随着CGA浓度增加，TAM细胞存活率升高，见图3。据此，选择50 μg/mL、100 μg/mL作为后续实验的CGA干预浓度。

图3 CGA对TAM样巨噬细胞存活率的影响

2.4 CGA对TAM样巨噬细胞形态的影响

50 μg/mL、100 μg/mL CGA 干预HepG2 诱导TAM，共培养48 h，随着CGA浓度增加，不规则圆形带伪足细胞和梭形细胞数量增多，见图4。

图4 CGA对TAM样巨噬细胞形态的影响（×20）

2.5 各组TAM样巨噬细胞极化相关基因表达水平比较

与M0 组比较，TAM 组IL-10、CD163、COX-2基因表达水平升高；与TAM 组比较，CGA 处理后M2型巨噬细胞标志物IL-10、CD163基因表达水平下降，M1 型巨噬细胞标志物IL-6、COX-2基因表达水平上升，且TAM+100 μg/mL CGA 组CD163基因表达水平高于TAM+50 μg/mL CGA组，见表1。

表1 各组TAM样巨噬细胞极化相关基因表达水平比较±s，n=3

表1 各组TAM样巨噬细胞极化相关基因表达水平比较±s，n=3

与M0组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与TAM组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与TAM+50 μg/mL CGA组比较，&P＜0.05。

3 讨论

巨噬细胞在先天免疫和适应性免疫中均发挥着关键作用，具有显著的表型异质性和功能多样性。在TME 中，TAM 根据表型和功能的不同被区分为M1样TAM和M2样TAM两种特殊类型[10]。研究发现，逆转M1样TAM向M2样TAM极化有助于机体对抗肿瘤的发展和转移[14]。有学者将THP-1加药极化为M1或M2后与肿瘤细胞共培养，探究不同类型的TAM对使用化疗药物的肿瘤细胞的影响，结果发现，M2 巨噬细胞对依托泊苷诱导的HepG2 和A549 癌细胞凋亡具有明显的保护作用，而M1 巨噬细胞则相反[15]。本研究将THP-1 细胞活化为M0 巨噬细胞后与HepG2 细胞共培养构建体外TAM 模型，结果显示，M0型巨噬细胞极化为TAM后变为不规则类圆形，不规则细胞数占细胞总数比例增加，该形态学变化与结直肠肝转移瘤病理切片研究中TAM的形态学结果相似[16]；且M2型TAM样巨噬细胞标志物IL-10、CD163mRNA表达上调，同时TAM中抑制肿瘤进展的M1 型巨噬细胞标志物COX-2mRNA 表达亦明显上调，而IL-6表达无统计学差异。以上结果提示，M0 巨噬细胞与HepG2 共培养48 h后可极化为M2样TAM。

有研究报道，CGA 可抑制人结肠癌HCT116 细胞和HT29 细胞的增殖；CGA 诱导活性氧的生成并使得细胞周期阻滞在S 期，抑制这两种细胞中ERK的激活从产生抗癌作用[17]。Xue 等[18]研究发现，在体内、外恶性神经胶质瘤模型中，CGA 通过促进STAT1 的激活或抑制STAT6 的激活来调节RAW264.7 巨噬细胞M2 到M1 的极化，从而抑制胶质瘤的发展。本研究结果显示，50 μg/mL、100 μg/mL CGA 处理TAM 48 h 后，随着浓度增加TAM 样巨噬细胞由不规则的圆形生出伪足，变成狭长的梭形，梭形细胞数量增多；M1型巨噬细胞相关标志物IL-6、COX-2表达水平上升，M2 型巨噬细胞相关标志物IL-10、CD163表达水平下降，且100 μg/mL 较50 μg/mL干预作用更强。以上结果表明，CGA能抑制M2 型TAM 样巨噬细胞标志物的表达，增强M1型巨噬细胞标志物的表达，提示CGA 可促进体外HepG2细胞诱导的M2样TAM向M1样巨噬细胞极化。

综上所述，本研究通过构建体外HepG2诱导的M2 样TAM，并用不同浓度CGA 干预，结果显示CGA 可以促进肝癌相关TAM 由M2 样向M1 样TAM 极化，提示这可能是CGA 抗肝癌作用机制之一，为进一步研究CGA抗肿瘤机制提供新的思路。