马宁 徐宁 尹冬 郑萍 刘伟伟 王国凤 惠媛 成兴波

我国目前约有1.096亿糖尿病(DM)患者，居全球首位[1]，其中约25%～40%可发展为糖尿病肾病(DKD)[2]，是慢性肾脏疾病(CKD)和终末期肾病的主要原因[3-4]，也成为我国住院CKD患者的主要病因[4]。DKD是由多种因素协同作用导致[5]，最终出现大量蛋白尿、肾功能不全甚至肾衰竭[6]，临床只能对症治疗，无有效的根治方法[7]，预后差。因此早期发现及治疗DKD尤为重要。现有研究表明通过相关组织微小RNA(miRNA，miR)谱的差异表达可进行2型糖尿病(T2DM)的早期诊断[8]，通过靶向炎症、纤维化和氧化应激等相关基因与靶mRNA的3’-非翻译区(UTR)结合，降低蛋白质的表达，从而对基因表达起调控作用[9]，用于诊断或预测DKD。本研究通过探究血小板反应蛋白(TSP)-1 mRNA和miR-194与2型糖尿病肾病的关系，探讨其在评估2型糖尿病肾病中的作用。

对象与方法

1.对象：2019年1月～6月在连云港市第一人民医院内分泌科住院的T2DM患者167例(T2DM组)，其中男84例，女83例，年龄29～81岁，平均年龄(59.34±12.94)岁。T2DM的诊断符合1999年WHO糖尿病的诊断标准。DKD的诊断符合2017年中国糖尿病指南诊断标准。随机选择同期于我院门诊健康体检者163例为健康对照组，其中男81例，女82例，年龄27～84岁，平均年龄(54.76±18.77)岁。两组受试者年龄、性别比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。排除标准：(1)1型糖尿病及糖尿病急性并发症；(2)自身免疫性疾病或其他内分泌系统代谢疾病如肾上腺皮质功能异常、甲状腺功能异常等；(3)原发性肾病或继发性肾脏疾病；(4)存在可能影响尿液检查结果或肾功能的疾病；(5)严重心血管疾病、肝肾功能不全、肿瘤；(6)妊娠、哺乳期或长期服用避孕药。按照2007年美国国家肾脏基金会(NKF)制定的《肾脏病生存质量指导糖尿病和慢性肾脏病临床实践指南和推荐》提出的标准，根据尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)将T2DM患者分为正常白蛋白尿组(UACR<30 mg/g,56例)、微量白蛋白尿组(30 mg/g≤UACR<300 mg/g，55例)及大量白蛋白尿组(UACR≥300 mg/g，56例)。本研究经我院伦理委员会审核批准，所有受试者或其亲属均签署知情同意书。

2.方法

(1)一般资料和实验室检查结果收集：收集所有受试者的一般资料，包括性别、年龄、BMI、血压。所有受试者采血前均清淡饮食，隔夜空腹12 h，次晨抽取肘静脉血5 ml检测空腹血浆葡萄糖(FPG)、总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、空腹胰岛素(Fins)、空腹C肽(FCP)、肌肝(Cr)、胱抑素C(Cys-C)、血尿酸(SUA)、糖化血红蛋白(HbA1c)、尿微量白蛋白水平，计算UACR。

(2)miR-194水平检测：严格按照说明书进行操作，第一步为使用MagMAXTMmirVanaTMRNA Isolation Kit试剂盒在Kingfisher Flex核酸提取工作站上提取核酸。第二步为使用含有探针的TaqManTMUniversal MasterMix Ⅱ进行荧光定量聚合酶链式反应(PCR)反应，针对人miR-194-5p序列的特异性引物(购自Applied Biosystems)，使用cel-miR-39为外参对照[序列UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG(Mature miRNA Sequence]在Invitrogen下单合成。依据2-△△Ct公式计算T2DM组相对于健康对照组受试者血清中miR-194水平的相对变化倍数。

(3)TSP-1 mRNA的检测：使用MagMAXTMmirVanaTMRNA Isolation Kit试剂盒在Kingfisher Flex核酸提取工作站上提取核酸。使用人GAPDH为外参对照。依据2-△△Ct公式计算T2DM组相对于健康对照组受试者血清中TSP-1 mRNA水平的相对变化倍数。

结 果

1.健康对照组和T2DM组受试者一般资料、实验室检查结果、miR-194及TSP-1 mRNA表达水平比较：T2DM组患者收缩压、舒张压、FPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、SUA、miR-194及TSP-1 mRNA水平均高于健康对照组，BMI、HDL-C水平均低于健康对照组(P<0.05)。见表1。

表1 健康对照组和T2DM组受试者一般资料、实验室检查结果、miR-194及TSP-1 mRNA表达水平比较

2.不同UACR组DKD患者miR-194及TSP-1 mRNA表达水平比较：TSP-1 mRNA及miR-194表达水平在正常白蛋白尿组、微量白蛋白尿组及大量白蛋白尿组患者中比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同UACR组DKD患者miR-194及TSP-1 mRNA表达水平比较

3.T2DM患者miR-194及TSP-1 mRNA表达水平与各因素的相关分析：Pearson或Spearman相关分析结果显示，T2DM患者TSP-1 mRNA与Cys-C(r=0.281,P=0.021)、UACR(r=0.317，P=0.009)呈正相关，miR-194与UACR(r=0.405,P=0.003)呈正相关。多元线性逐步回归分析结果显示，T2DM患者Cys-C(β=0.578,P=0.021)、UACR(β=0.001,P=0.009)是TSP-1 mRNA的独立影响因素，UACR(β=0.005,P=0.028)是miR-194的独立影响因素。

4.2型糖尿病肾病诊断价值的评估：ROC曲线分析结果显示，TSP-1 mRNA及miR-194诊断2型糖尿病肾病的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.756(95%CI0.620～0.893，P<0.01)和0.584(95%CI0.421～0.748，P<0.01)，二者均对2型糖尿病肾病具有一定的诊断评估价值。

讨 论

1990年Good等[10]第一次成功在人体血小板中分离出TSP-1，这是一种内源性抗血管生成因子[11-12]，与肾脏疾病关系密切[13-14],可能参与糖尿病的发生[15]。其在正常成人肾脏中分布很少，但当机体处于高糖状态、发生炎性反应或早期间质纤维化时，其表达水平明显升高[16-17]，尤其在缺血-再灌注肾损伤、肥胖和糖尿病相关性肾病中[18-19]。动物实验表明TSP-1基因和蛋白在糖尿病肾病大鼠肾组织中高表达，后期开始下调，PEDF基因和蛋白表达下调，且呈递减趋势[20]。如果敲除TSP-1，则能降低糖尿病动物模型的尿蛋白水平和肾功能损伤情况[21]。

我们前期研究发现在T2DM微血管病变患者血清中，TSP-1表达水平较高[22]，推测其参与了DKD的病理生理过程[23]。在本研究中，我们发现TSP-1 mRNA在T2DM患者血清中表达水平明显升高，同时也发现T2DM组患者收缩压、舒张压、FPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、SUA水平均高于健康对照组，与既往文献结论一致[24]。在不同程度尿微量白蛋白DM患者中，TSP-1mRNA表达水平差异也存在统计学意义。相关性分析发现，TSP-1 mRNA与Cys-C、UACR呈正相关，提示TSP-1 mRNA参与DKD病理生理过程。多元线性逐步回归分析结果显示，Cys-C和UACR是TSP-1 mRNA的独立影响因素。通过应用TargetScan、miRanda及PicTar等miRNA靶基因预测软件，预测miR-194的潜在靶基因可能是TSP-1(图1)，推测miR-194与TSP-1 mRNA参与了DKD的发病过程。

图1 应用预测人miR-194-5p与TSP-1 mRNA的3’-UTR 区存在较强的互补结合性(http://www.microrna.org/microrna/)

本研究发现，miR-194在T2DM组患者中表达明显升高，在不同UACR组患者间miR-194表达水平差异也存在统计学意义。相关分析结果显示，miR-194与UACR呈正相关，提示miR-194参与DKD病理生理过程。多元线性逐步回归分析显示，UACR是miR194的独立影响因素。目前已知一些miRNA与DKD相关，如miR-146、miR-192、miR-216、miR-377、miR-1303[25]、miR-23b[26]、miR-30a[27]及miR-21[28]。在实验动物模型中，miR-21、miR-29C、miR-192、miR-214和miR-433或过表达的miR-29b等miRNA均可有效减少肾纤维化[29]。但miR-194相关文献较少，本研究是有益补充。

临床工作中常发现有部分DKD患者肾脏损害较严重，但其微量白蛋白尿可转为正常白蛋白尿[30-31]，且通过合理降糖仍可有效降低肾小球滤过率(GFR)[32]，说明这些都不能完全反映真实肾脏病变。另外近年研究结果也发现Cys-C、尿α-微球蛋白、IgG或IgM、Ⅳ型胶原蛋白等与DN早期诊断有关的指标各有利弊[33]。本研究应用ROC曲线发现miR-194及TSP-1 mRNA与健康对照组的AUC分别为0.584和0.756，同时与其他相关肾脏指标相比，具有一定的评估价值。但关于TSP-1 mRNA和miR-194调控DKD发生发展的具体机制尚不明确，需进一步研究明确。