付伟祥，宋小超，赵利影，卢怡光，王俊东，张建海

（山西农业大学动物医学学院，太谷 030801）

全球砷污染已成为一个严重的问题，数以百万计的人通过饮水和食物接触到高剂量的砷［1］。流行病学调查证实，接触砷与皮肤病理、心血管疾病、糖尿病、发育性神经毒性和基因毒性有关［2］。砷暴露会干扰心肌细胞代谢，引起心脏线粒体损伤［3］，引起各种呼吸道疾病，增加肺癌的风险［4］。低水平的砷还会对大脑突触的神经传递产生有害影响，进一步引起神经行为障碍［5］。无机砷在几乎所有细胞和组织中都表现出急性和慢性毒性，会引起多器官衰竭［6］。因此，探索缓解砷中毒的方法刻不容缓。

核黄素（riboflavin，VB2）是B族维生素中的水溶性成员［7］，补充VB2对各种疾病治疗（如败血症、缺血等）有辅助作用。同时，它还有助于降低人类罹患某些癌症的风险。VB2因其抗氧化、抗衰老、抗炎和抗癌特性被广泛研究［8］。最近的研究证明，VB2在小鼠异位心脏移植模型中降低了缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）后心肌的氧化应激［9］。我们最近的研究也证实了VB2对氟化物导致的大脑皮层形态损伤有明显的缓解作用［10］。根据这些结论，我们推测VB2可能在砷中毒对心、肺和脑的损害中发挥作用。

因此，本研究建立了VB2干预砷暴露小鼠模型，对其心、肺和脑进行组织形态学观察，探讨VB2减轻砷导致器官组织损伤的可能性，进一步为砷中毒的机制和防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

48只5周龄ICR雄性小鼠购于山西医科大学，体重20 g左右。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物的分组及染毒

48只5周龄雄性小鼠，适应性饲养1周后，随机分为4组，每组12只，分别为对照组（蒸馏水）、砷组（20 mg/L As2O3）、核黄素组（20 mg/L VB2）、砷+核黄素组（20 mg/L As2O3+20 mg/L VB2）。17周后，称取小鼠及其脏器的质量，计算脏体比。脏器系数＝脏器湿质量（g）/体质量（g）×100%。

1.2.2 苏木精-伊红染色组织切片

采取部分组织于4%多聚甲醛（pH=7.2）固定液中固定48 h后用流水充分漂洗，进行修块（厚度约0.3 cm，切片平整），经梯度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡后，用石蜡包埋组织，于切片机上切成5 μm的薄片。将其捞至干净的载玻片上，并于56℃烤片直至蜡融化。梯度酒精脱水后，苏木精染液染色5 min，自来水蓝化20 min，伊红染色30 s，最后经梯度酒精脱水，二甲苯透明后封片，在光学显微镜下镜检观察组织形态学变化并采集图片。

1.2.3 数据处理

采用GraphPad Prism 8软件进行数据统计，测定结果用平均值±标准差（x±s）表示。差异显著性利用one-way ANOVA（analysis of variance）进行分析，*代表P＜0.05差异显著，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001，****代表P＜0.0001差异极显著（与对照组相比）。

2 结果与分析

2.1 VB2干预砷中毒小鼠心、肺和脑的脏器系数变化

由图1a可知，与对照组相比，砷暴露不能改变小鼠心、肺以及脑的质量，但核黄素与砷共处理后小鼠肺的质量增加，与对照组相比差异极显著（P＜0.0001）。图1b结果显示：砷暴露不能导致心、肺和脑的脏器系数改变，但核黄素与砷共处理可使得心、肺的脏器系数与对照组相比显著增加（P＜0.05，P＜0.001）；核黄素处理组小鼠脑的脏器系数增加，与对照组相比差异显著（P＜0.01）。

图1 核黄素对砷中毒小鼠心、肺、脑脏器系数的影响Fig. 1 Effect of riboflavin on cardiopulmonary organ coefficient in arsenism mice（a）小鼠心、肺、脑质量的变化；（b）小鼠心、肺、脑脏器系数的变化。星号表示组间差异有统计学意义。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。(a) Changes of heart, lung and brain weight in mice; (b) Changes of cardiopulmonary and cerebral organ coefficients in mice. Statistical analysis of invasion capacity. The asterisks indicate a statistically significant difference. *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001, ****P＜0.0001.

2.2 VB2干预砷中毒小鼠心脏组织形态学的变化

从图2a可以看出，对照组心肌纤维束排列整齐、紧凑，组织结构清晰可见。砷处理组心肌纤维收缩、弯曲，心肌纤维束间隙增宽。同时，核黄素的添加有效改善了这种现象，减少了心肌纤维的弯曲、紊乱，但没有完全恢复至对照组状态。核黄素处理组与对照组比较无明显变化。图2b结果显示：砷处理组心肌细胞排列紊乱，体积增大，细胞间隙中纤维分离，甚至出现断裂现象；添加核黄素后纤维断裂消失，间隙增宽现象减轻。

图2 核黄素对砷中毒小鼠心脏组织形态学的影响Fig. 2 Effects of riboflavin on cardiac histomorphology in arsenism mice（a）小鼠心脏组织形态学图片（20×）；（b）小鼠心脏组织形态学图片（40×）。(a) Morphological images of mouse heart tissue (20×); (b) Morphological images of mouse heart tissue (40×).

2.3 VB2干预砷中毒小鼠肺组织形态学的变化

由图3a可见：对照组肺的结构正常，肺泡完整，大小肺泡清晰可见，由肺泡壁连接成网状；砷处理组与对照组相比，肺泡壁增厚，多数肺泡腔缩小，有的肺泡破裂融合在一起，失去网状结构；核黄素则明显改善了砷导致的这些病理变化，使肺泡恢复正常状态；核黄素处理组与对照组比较无明显变化。图3b结果显示：砷处理组支气管壁增厚，肺泡壁增厚，连接在一起，肺的形态基本消失；添加核黄素后支气管清晰可见，与对照组无差异，肺泡壁增厚现象消失不见。

图3 核黄素对砷中毒小鼠肺组织形态学的影响Fig. 3 Effects of riboflavin on lung histomorphology in arsenism mice（a）小鼠肺组织形态学图片（20×）；（b）小鼠肺组织形态学图片（40×）。(a) Morphological image of mouse lung tissue (20×); (b) Morphological image of mouse lung tissue (40×).

2.4 VB2干预砷中毒小鼠大脑皮层组织形态学的变化

如图4a所示，对照组锥体细胞和胶质细胞清晰可见，排列紧凑、密集，呈现一定的方向性，细胞核清晰，染色明显。砷处理组与对照组相比，细胞数量明显减少，排列紊乱，较多的细胞核染色变浅，细胞轮廓模糊不清。添加核黄素后，细胞数量有所增加，细胞核染色清晰可见，但仍排列紊乱。核黄素处理组与对照组无异。由图4b中可见，砷处理组大脑皮层锥体细胞与角质细胞形态模糊，很难分辨，细胞核发生肿大，染色明显变浅，有的细胞溶解、消失。添加核黄素后，仍可见少量肿大的细胞，但与砷处理组相比有明显改善。

图4 核黄素对砷中毒小鼠大脑皮层组织形态学的影响Fig. 4 Effects of riboflavin on cortical histomorphology in arsenism mice（a）小鼠大脑组织形态学图片（20×）；（b）小鼠大脑组织形态学图片（40×）。(a) Histomorphological image of mouse brain tissue (20×); (b) Histomorphological image of mouse brain tissue (40×).

3 讨论

砷可以广泛地侵入机体各个器官或组织，损伤其结构和功能，导致机体严重受损。砷中毒会使心脏钙稳态发生紊乱，降低心脏抗氧化功能和激活氧化应激，导致心脏毒性的发生［11］。同时，砷暴露可触发大鼠肺组织发生炎症反应，引起胶原纤维的沉积［12］。Amuno等［5］的研究表明，高砷地区动物大脑中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GPx）的活性水平偏高，大脑的抗氧化能力降低。Sharma等［13］的研究也表明，砷处理使白化病小鼠大脑脂质过氧化（lipid peroxidation，LPO）水平升高，谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平显著降低。这些均表明，砷的毒性表现与氧化应激有关，砷进入机体后导致氧化和抗氧化失衡，有毒的自由基在富含磷脂的膜状结构（如线粒体、内质网）中诱导连锁反应和脂质过氧化，如细胞凋亡、坏死、铁死亡和自噬等多种生物学过程，直接损伤细胞膜并产生许多次级产物，导致组织广泛的细胞损伤［14］。这可能是砷引发各器官组织损伤的原因之一。

一些抗氧化剂，如紫檀茋、姜黄素、葡萄籽原青花素等也被报道可通过抗氧化等功能减轻砷中毒导致的某一组织器官损伤。但是否对砷中毒导致的多器官损伤起缓解作用还未可知，且有的抗氧化剂提取繁琐或价格昂贵，不能有效地应用于临床与实践。VB2广泛存在于各类食物中［15］，通过黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）和黄素单核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）的作用形式，在呼吸链的电子传递过程和各种酶促反应中发挥关键作用［16］。VB2在多种疾病损伤中有良好的治疗作用［17］，可缓解小鼠心肌缺氧/缺血损伤［18］，改善脂多糖诱导的肺部炎症等［19］。

本试验对心脏、肺和大脑的脏器系数和组织形态学进行了综合分析，发现VB2添加对砷中毒心脏和肺的损伤有显著的缓解效果。VB2较好地改善了砷导致的大脑皮层神经细胞数量的减少的情况，这可能与VB2的抗氧化、抗衰老、抗炎、抗伤害等生物学功能有关，但具体作用机制有待进一步研究。