龙亚飞，唐佳代，王 帅，吕相华，吴德光，2

（1.茅台学院酿酒工程系，贵州仁怀 564500；2.天津科技大学生物工程学院，天津 300000）

酱香型白酒具有酱香突出，香气优雅细腻，口味醇厚，回味悠长，空杯留香持久的独特风格。酱香酒的特征在一定程度上是由其独特的生产工艺（即高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温流酒和生产周期长、贮存期长）、气候和微生物多样性决定的。其中，高温堆积是酱香型白酒特有的酿造工艺，大量酿造环境中的微生物在此过程中富集，为窖池发酵提供了大量的微生物储备、酶类资源和香味物质及其前体物质。近年来，“酱酒热”仍在持续，2020 年，以贵州茅台酒为代表的酱香型白酒净利润约为455 亿元，利润率达到46.38%。扣囊复膜酵母（），又称拟内孢霉，是子囊菌门（Ascomycota）酵母亚门(Saccharomycotina)下酵母纲(Saccharomycetes)酵母目(Saccharomycetales)酵母科(Saccharomycetace)复膜酵母属()的一个种。该菌株是多种酒曲和酒醅中的主要酵母之一，产淀粉酶、酸性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶，所产的酶都具有较高的活性，在酿酒工业中，这些酶活性决定了扣囊复膜酵母能够以各种原料为底物，进行发酵产酒精。不少研究发现扣囊复膜酵母能产香产酯并利用丢糟生产单细胞蛋白饲料。白酒糟是酿酒行业最大的副产物，产量巨大且营养丰富，是一种很好的生物质资源，白酒酒糟中还含有一些残余淀粉。因此，研究酱香堆积酒醅中扣囊复膜酵母及该菌利用酒糟酒醅混合液发酵产酒精能力十分有价值。

本研究采用平板分离筛选酱香堆积酒醅中的扣囊复膜酵母菌，并通过分子生物学法对其进行鉴定，探索该菌种利用酒糟及酒醅混合液产酒精的最佳工艺条件，为该菌种的进一步开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 酒醅及酒糟

酒醅取自贵州省仁怀市红土地酿酒作坊第三轮次堆积酒醅；酒糟取自贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司。

1.1.2 试剂

蛋白胨、酵母浸膏、琼脂、乙醇、D（+）-麦芽糖、硫酸镁·7HO，国药集团化学试剂有限公司；可溶性淀粉、葡萄糖、α-乳糖、磷酸二氢钾，天津市科密欧化学试剂有限公司；蔗糖、硫酸铵、氯化钙·HO、氯化钠，成都金山化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

YPD 培养基：每1000 mL 中，酵母浸膏10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，琼脂20 g，pH值自然。

1.1.4 仪器设备

本研究用到的仪器及设备见表1。

表1 仪器设备及规格

1.2 实验方法

1.2.1 扣囊复膜酵母的分离鉴定

（1）分离纯化

称取酱香型堆积酒醅1.0 g，加入到99 mL 带玻璃珠的无菌水中，摇床振荡5 min 进行10 倍系列稀释（10、10、10、10、10、10、10、10）。各取1 μL 稀释液涂布于YPD 平板上进行涂布分离，在28 ℃恒温培养箱中倒置培养2 d 后挑取形态不同的单菌落，多次在YPD 平板上划线纯化，获得纯培养的菌株。

（2）形态学鉴定

将纯化获得的扣囊复膜酵母接入YPD 固体培养基上，28 ℃倒置培养2 d，观察其菌落形态；将纯化获得的扣囊复膜酵母接种到YPD 液体培养基中，在28 ℃、160 r/min 摇床培养箱中培养，在12 h、24 h、36 h、48 h 时分别取样，用显微镜观察细胞形态并拍照。

（3）分子鉴定

菌落形态和细胞形态鉴定后获得的酵母菌株，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，以NL1和NL4 为上下游引物，扩增26S rDNA 目标基因对菌株进行分子鉴定。测序结果在NCBI数据库中进行同源性比对分析。

1.2.2 单因素发酵条件对酒精产量的影响研究

为探究发酵温度、发酵时间、菌株接种量及酒糟与酒醅比在扣囊复膜酵母发酵过程中对酒精产量的影响，将筛选出的扣囊复膜酵母菌株（S-9）按照不同发酵条件（发酵温度、发酵时间、菌株接种量）接种于不同比例的酒糟、糟醅混合液中，通过测量酒精的产量来确定各个单因素的最佳条件。酒精含量测定方法采用气相色谱法：美国安捷伦科技有限公司，色谱柱：CP-Wax57CB(50 m×0.25 mm×0.2 μm)聚乙二醇石英毛细管柱；进样口温度240 ℃；检测器温度280 ℃；进样量1 μL；载气流量1.0 mL/min；分流比15∶1；氢气（H）∶空气（O）∶尾吹气（N）=400∶40∶25。升温程序：初温40 ℃，保持5 min；以5 ℃/min 升至110 ℃，以20 ℃/min 升至280 ℃，保持30 min。

1.2.3 正交实验

在单因素试验的基础上，选取菌种接种量、温度、时间、糟醅比4 个因素，进行4 因素3 水平正交实验，进一步考察各因素对酒精产量的影响，正交条件如表2所示。

表2 扣囊复膜酵母产酒精四因素三水平正交条件表

2 结果与分析

2.1 分离鉴定

利用YPD 作为培养基对扣囊复膜酵母进行菌株筛选，在平板上28 ℃培养2 d，经菌落形态以及菌株镜检观察，共筛选分离到9 株（分别命名为S-1、S-2、S-3、S-4、S-5、S-6、S-7、S-8、S-9）具有酵母特征的菌株（见图1、图2）。

图1 酵母菌初筛

图2 扣囊复膜酵母的菌落和细胞形态特征

在形态学观察的基础上，本研究对筛选出的9株菌进行分子水平鉴定，PCR 产物测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，所得序列在NCBI数据库中进行Blast 同源性比对，比对结果见表3，确定5株为扣囊复膜酵母。

表3 酵母菌株26S rDNA鉴定结果

2.2 单因素发酵条件对扣囊复膜酵母酒精产量的影响

本研究选取4 个因素，包括菌株接种量（10～10个/mL）、发酵温度（24～32 ℃）、发酵时间（24～120 h）、糟醅比（1∶1～1∶5），对筛选到的S-9 菌株发酵产酒精条件做了进一步研究。菌株的接种量是影响酒精产量的重要因素之一，如图3A 所示，当扣囊复膜酵母的接种量为10个/mL 时，菌株的酒精产量最高，达到2480 ng/μL。在考察发酵温度对酵母菌产酒精能力的影响时发现（见图3B），菌株S-9的酒精产量随着温度升高先上升、后降低，这可能与扣囊复膜酵母最适生长温度有关，温度偏高或偏低对菌株的发酵产酒精均有明显的抑制作用，在28 ℃时产量最高，达到3594 ng/μL。发酵时间不同程度上影响着扣囊复膜酵母菌株的酒精产量，如图3C 所示，当发酵时间为96 h 时，S-9 菌株酒精产量达到最高值，为2738 ng/μL，随着发酵时间延长可能酒精挥发了，导致酒精产量降低。糟醅比对扣囊复膜酵母产酒精影响比较大（图3D），这可能与糟醅混合液中淀粉成分的含量有关，研究发现，随着酒醅添加量的增加，酒精产量先增加后减少，可能是扣囊复膜酵母接种量不够，糟醅比1∶3是最适合的底物配比，酒精产量高达3455 ng/μL。

图3 单因素发酵条件对扣囊复膜酵母菌株酒精产量的影响

2.3 正交实验结果

根据单因素实验结果，选取4 个因素各3 个水平进行菌株产酒精能力研究，包括A 菌株接种量（10个/mL、10个/mL、10个/mL）、B 发 酵 温 度（26 ℃、28 ℃、30 ℃）、C发酵时间（72 h、96 h、120 h）、D 糟醅比（1∶2、1∶3、1∶4）进行正交实验，以确定菌株S-9 产酒精的最优发酵条件，正交表见表2。菌株S-9 的产酒精条件结果和极差分析见表4，结果表明，4 个影响因素中糟醅比对酒精的产量影响程度最大，4 个因素的影响程度由高到低排序为糟醅比＞发酵温度＞发酵时间＞菌株接种量。根据实验结果综合分析，最优组合为ABCD，即接种量为10个/mL，发酵温度为26 ℃，发酵时间为72 h，糟醅比为1∶2，此条件下酒精的产量为3672 ng/μL。

表4 S-9菌株产酒精条件的正交实验结果

3 结论

本研究通过菌落形态、细胞形态分析从酱香堆积酒醅中分离出9 株酵母菌，经分子鉴定，确定5株为扣囊复膜酵母。对其中1 株进行酒精发酵研究，单因素实验最佳条件为：发酵温度28 ℃，发酵时间96 h，接种扣囊复膜酵母量10个/mL，最佳糟醅比1∶3。正交实验的最佳组合为ABCD，即接种量为10个/mL，发酵温度为26 ℃，发酵时间为72 h，糟醅比为1∶2。为进一步研究扣囊复膜酵母在酱香白酒生产及白酒糟回收利用中的应用提供参考。