蔡颖　杨英捷

摘要 目的：研究異槲皮苷通过内质网应激和自噬途径诱导宫颈癌细胞凋亡的作用机制。方法：将SiHa细胞随机分为对照组、异槲皮苷低剂量组、异槲皮苷中剂量组和异槲皮苷高剂量组。异槲皮苷低、中、高剂量组细胞分别使用终浓度为20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L的异槲皮苷培养，对照组细胞使用正常培养基培养。使用CCK-8分别在24 h、48 h和72 h检测细胞增殖情况;EDU检测各组细胞在72 h时的增殖情况;荧光定量PCR检测各组细胞内质网应激相关mRNA的表达;Western Blotting检测各组细胞蛋白表达情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果：与对照组细胞比较，低、中、高剂量异槲皮苷作用后，细胞OD值均明显降低;葡萄糖调节蛋白78 mRNA、CHOP mRNA以及葡萄糖调节蛋白78蛋白、C/EBP同源蛋白质（CHOP）、胱天蛋白酶12蛋白、Beclin 1蛋白、Bax蛋白、Cl-胱天蛋白酶-3蛋白表达水平以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显升高;P62蛋白、Bcl-2蛋白、p-JAK2蛋白和p-信号转导及转录激活蛋白3表达水平均明显降低;细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。且异槲皮苷的作用呈剂量依赖性。结论：异槲皮苷可通过内质网应激途径和自噬途径，诱导宫颈癌细胞凋亡。

关键词 异槲皮苷;宫颈癌;内质网应激;增殖;自噬;凋亡;JAK/信号转导及转录激活蛋白信号通路

Mechanism of Isoquercitrin in Inducing Apoptosis of Cervical Cancer Cells Through

Endoplasmic Reticulum Stress and Autophagy Pathways

CAI Ying，YANG Yingjie

（1 School of Obstetrics and Gynecology，Graduate School of Guizhou Medical University，Guiyang 550000，China;

2 Gynecological Tumor Surgery of Guizhou Cancer Hospital，Guiyang 550000，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of isoquercitrin in the induction of apoptosis in cervical cancer cells through endoplasmic reticulum stress and autophagy pathways.Methods：The SiHa cells were randomly divided into a control group，and low-（20 μmol/L），medium-（40 μmol/L），and high-dose（80 μmol/L） isoquercitrin groups.The cells in the isoquercitrin groups were cultured with corresponding drugs，and those in the control group with normal medium.The cell proliferation was detected at 24 h，48 h，and 72 h using CCK-8 kits.EDU was used to detect the proliferation of cells in each group at 72 h.The expression of endoplasmic reticulum stress-related genes was detected by qRT-PCR.The protein expression in each group was detected by Western blot.Cell apoptosis was detected by flow cytometry.Results：Compared with the control group，the isoquercitrin groups showed reduced OD values in cells，increased expression levels of glucose-regulated protein 78（GRP78） mRNA，CHOP mRNA，GRP78 protein，CHOP protein，Caspase-12 protein，Beclin 1 protein，Bax protein，Cl-caspase-3 protein，and the LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ ratio，decreased expression levels of p62 protein，Bcl-2 protein，p-JAK2 protein，and p-STAT3 protein，and elevated apoptosis rate（P<0.05）.The effect of isoquercitrin was in a dose-dependent manner.Conclusion：Isoquercitrin can induce apoptosis of cervical cancer cells through endoplasmic reticulum stress and autophagy pathways.

Keywords Isoquercitrin; Cervical cancer; Endoplasmic reticulum stress; Proliferation; Autophagy; Apoptosis; JAK/STAT signaling pathway

中图分类号：R284;R737.33文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.008

宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，是威胁女性健康的第二大癌症，其产生的原因可能与人乳头瘤病毒（Human Papilloma Virus，HPV）感染、性混乱及初次性交年龄过早等高危因素有关[1]。尽管宫颈癌的广泛筛查和疫苗开发取得了重大进展，但宫颈癌在发展中国家的发病率和死亡率仍较高。目前对晚期或复发性宫颈癌还是以放射治疗和化疗作为主要的治疗方法，但放射治疗和化疗会产生严重的不良反应和耐药性[2]。因此，近年来对于天然药物在肿瘤的治疗过程中的研究越来越得到关注，天然药物具有多途径、多环节、多靶点、不良反应小等优势，已成为抗癌药物的重点研发对象[3-4]。异槲皮苷属黄酮类化合物，也被称为罗麻甲素和槲皮素3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，异槲皮苷是桑叶、荷叶、黄秋葵、辣木叶等中草药和天然植物中的重要活性成分[5]。具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂、抗动脉粥样硬化、降血糖、神经保护等生物活性，具有较大的药用价值和应用前景[6]。现对异槲皮苷对宫颈癌细胞的作用进行研究，并进一步探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人宫颈癌细胞株SiHa（已查无污染）购于美国模式培养物集存库（ATCC）。细胞解冻后，转入含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM细胞培养基中，1 000 r/min，离心半径10 cm，离心10 min，弃上清，用培养基重悬细胞并接种于培养瓶中，置于37 ℃，5% CO的细胞培养箱中进行培养。2 d更换1次培养基，待细胞融合度达到80%时进行传代。本研究经过贵州医科大学伦理委员会审核批准（伦理审批号：贵L200618）。

1.1.2 药物 异槲皮苷（中国食品药品检定研究院，批号：111809-201804）。

1.1.3 试剂与仪器 DMEM细胞培养基[赛百慷（上海）生物技术股份有限公司，货号：iCell-0001];CCK-8 Cell Counting Kit（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：A311-02）;Trizol（北京索莱宝科技有限公司，货号：15596-026）;T7高效RNA转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：DD4201）;Talent qPCR PreMix（SYBR Green）[天根生化科技（北京）有限公司，货号：FP209-02];BCA蛋白定量试剂盒（上海康朗生物科技有限公司，货号：KL-X126）;ECL化学发光检测试剂盒[爱必信（上海）生物科技有限公司，货号：abs920];细胞凋亡检测试剂盒（日本同仁化学公司，货号：AD10-3）;DAPI（北京索莱宝科技有限公司，货号：D8200-10）;EdU细胞增殖检测试剂盒（广州市锐博生物科技有限公司，货号：C10310）;GRP78（货号：ab21685）、胱天蛋白酶12（货号：ab62484）抗体购买于英国Abcam公司;CHOP（货号：2895）、LC3 A/B（货号：12741）、Beclin 1（货号：3495）、P62（货号：88588）、Bcl-2（货号：4223）、Bax（货号：89477）、Cleaved-caspase-3（货号：9579）、Phospho-JAK2（货号：3771）、JAK2（货号：3230）、Phospho-STAT3（货号：9145）、STAT3（货号：9139）、GAPDH（货号：5174）抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG（货号：7074）均购买于美国CST公司。二氧化碳培养箱（Thermo Fisher Scientific公司，美国，型号：Forma Steri-Cycle）;全波长酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司，美国，型号：Multiskan Sky）;PCR仪（Bio-Rad公司，美国，型号：T100）;荧光定量PCR仪（诺禾致源，型号：Q225）;全自动电泳凝胶成像系统（Bio-Rad公司，美国，型号：Gel Doc EZ）;流式细胞仪（贝克曼库尔特公司，美国，型号：CytoFLEX S）;倒置荧光显微镜（徕卡公司，德国，型号：DMi8）。

1.2 方法

1.2.1 分组 将对数生长期细胞随机分为对照组、异槲皮苷低剂量（20 μmol/L）组、异槲皮苷中剂量（40 μmol/L）组和异槲皮苷高剂量（80 μmol/L）组，每组细胞均做9次重复。

1.2.2 干预方法 异槲皮苷低剂量组、异槲皮苷中剂量组和异槲皮苷高剂量组分别加入终浓度为20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L的异槲皮苷进行培养[7]，对照组细胞加入等量的DMEM正常培养基进行培养。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 CCK-8检测各组细胞增殖情况 制备SiHa细胞悬液，调整细胞密度为1×10个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL/孔，置于培养箱中培养24 h。异槲皮苷低剂量组、异槲皮苷中剂量组和异槲皮苷高剂量组加入浓度为20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L的异槲皮苷，对照组加入等量细胞培养基，每组设9个复孔，分别在培养24 h、48 h和72 h时往孔内加入CCK-8溶液10 μL，放入培养箱中避光孵育2 h，使用酶标仪在450 nm波长下检测各組细胞的OD值。

1.2.3.2 EdU检测各组细胞增殖情况 细胞按照1.2.2方法进行分组培养，在培养72 h时，往细胞中加入5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（5-Ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU），并在37 ℃下孵育2 h[8]。然后使用4%多聚甲醛固定30 min，在用Triton X-100透化细胞[9]。然后加入1×Apollo反应混合物培养细胞30 min。加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride，DAPI）溶液对细胞核染色5 min。在荧光显微镜下观察并拍照，对EdU阳性细胞进行计数，并计算阳性细胞百分率。

1.2.3.3 荧光定量PCR检测各组细胞内质网应激相关mRNA的表达水平 使用Trizol试剂法提取各组细胞的RNA，使用超微量紫外分光光度仪检测所提取RNA的纯度和浓度。使用T7高效RNA转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。按照Talent qPCR PreMix（SYBR Green）说明书方法配置荧光定量反应体系，使用荧光定量PCR仪进行反应，使用2-△△Ct法计算目标mRNA的相对表达量[10]。

1.2.3.4 Western Blotting检测各组细胞蛋白表达情况 收集各组细胞，并用预冷的磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-buffered Saline，PBS）清洗3次，加入放射免疫沉淀测定（Radioimmune Precipitation Assay，RIPA）裂解液和苯甲磺酰氟（Benzylsulfonyl Fluoride，PMSF）蛋白酶抑制剂，冰上静置30 min使细胞充分裂解。4 ℃、12 000 r/min，离心15 min，取上清液。使用2，2-联喹-啉-4，4-二甲酸二钠（Bicinchoninic Acid Disodium Salt，BCA）试剂盒检测蛋白质浓度，十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，随后转移至聚偏氟乙烯（Poly Vinylidene Fluoride，PVDF）膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h[11]。加入葡萄糖调节蛋白78（1∶600）、C/EBP同源蛋白质（CHOP）（1∶1 000）、胱天蛋白酶12（1∶800）、LC3 A/B（1∶1 000）、Beclin 1（1∶1 000）、P62（1∶1 000）、Bcl-2（1∶2 000）、Bax（1∶1 000）、Cl-胱天蛋白酶-3（1∶1 000）、p-JAK2（1∶1 000）、JAK2（1∶1 000）、p-信号转导及转录激活蛋白3（STAT3）（1∶1 000）、STAT3（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）抗体，4 ℃孵育过夜。Tris-HCl缓冲盐溶液+Tween（Tris Buffered Saline with Tween-20，TBST）洗膜后，加入辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG（1∶5 000），37 ℃孵育1 h。增强化学发光（Enhanced Chemiluminescence，ECL）试剂盒曝光显影，全自动凝胶成像仪拍照分析，根据灰度值计算目的蛋白表达水平。

1.2.3.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况 取各组细胞，使用胰酶消化，然后PBS漂洗，加入banding buffer重悬细胞，然后加入Annexin V-FITC和PI，放入培养箱中避光染色5 min，上流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况[12]。

1.3 统计学方法 将所得实验数据采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析，首先对数据进行正态性检验，符合正态分布的数据采用均值±标准差（±s）表示，不符合正态分布的数据使用非参数检验。对于符合正态性分布的数据，多组间数据比较采用单因素方差分析，2组数据比较时采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异槲皮苷抑制SiHa细胞增殖 由表1结果可以看出，在24 h时异槲皮苷不同剂量组OD值均较对照组明显降低（P<0.05）。在48 h时，异槲皮苷不同剂量组OD值较对照组明显降低（P<0.05）;且与异槲皮苷低剂量组比较，异槲皮苷中剂量组和高剂量组OD值明显降低（P<0.05）。在72 h时，异槲皮苷不同剂量组OD值均较对照组明显降低（P<0.05），且异槲皮苷低、中、高剂量组差异有统计学意义（P<0.05），异槲皮苷高剂量组OD值最低。与对照组比较，异槲皮苷作用后EdU阳性细胞率明显降低，且异槲皮苷浓度越高，EdU阳性细胞率越低，各组差异有统计学意义（P<0.05）。见图1、表1。

2.2 异槲皮苷体外激活内质网应激 与对照组比较，异槲皮苷不同剂量组葡萄糖调节蛋白78 mRNA、CHOP mRNA以及葡萄糖调节蛋白78蛋白、CHOP蛋白、胱天蛋白酶12表达水平均明显升高，即异槲皮苷可促进内质网应激相关指标的表达，且随着异槲皮苷所用剂量的升高，对于各项指标的促进作用增强，各组间差异有统计学意义（P<0.05）。见图2、表2。

2.3 异槲皮苷促进SiHa细胞发生自噬 与对照组比较，不同剂量异槲皮苷作用后LC3Ⅱ和LC3Ⅰ蛋白表达比值明显升高，Beclin 1蛋白表达水平明显升高，P62蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3、表3。

2.4 异槲皮苷诱导SiHa细胞凋亡 与对照组细胞比较，异槲皮苷作用后细胞凋亡率较对照组明显升高（P<0.05），且随着异槲皮苷剂量的升高，细胞凋亡率也呈明显增高的趋势。在异槲皮苷作用后，Bcl-2蛋白表达水平较对照组明显降低，Bax蛋白和Cl-胱天蛋白酶-3蛋白表达水平较对照组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4、表4。

2.5 异槲皮苷抑制SiHa细胞中JAK/信号转导及转录激活蛋白通路磷酸化水平 各组JAK2蛋白和信号转导及转录激活蛋白3蛋白表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。p-JAK2蛋白和p-信号转导及转錄激活蛋白3蛋白在低、中、高剂量异槲皮苷作用后表达水平与对照组比较均明显降低，且p-JAK2蛋白和p-信号转导及转录激活蛋白3水平随异槲皮苷剂量升高而降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5，表5。

3 讨论

宫颈癌是一种临床较为常见的、发生于宫颈部位的妇科恶性肿瘤，其临床表现主要是阴道出血、阴道排液等症状，且多发病于绝经初期及围绝经期的女性[13]。宫颈癌的转移和复发是导致患者死亡的主要原因。宫颈癌的发生、发展、消退与细胞凋亡有着密切联系，诱导癌细胞凋亡已是肿瘤治疗的热点和新靶点[14]。近年的研究发现，异槲皮苷可诱导癌症细胞凋亡，且可能存在抑制细胞癌化的作用[15-16]。

研究发现，内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）发生于多种形式的癌症中，可能是调节细胞凋亡和增殖的重要环节[17]。未折叠蛋白质反应（Unfolded Protein Reaction，UPR）是介導ERS发生最重要的信号机制。葡萄糖调节蛋白78是参与UPR的标志性蛋白分子，可以用来提示ERS的发生。当ERS激活时间延长时，可能通过CHOP和胱天蛋白酶12的过表达引发细胞凋亡。CHOP可以改变许多凋亡相关基因的表达，通过线粒体依赖途径诱导细胞凋亡[18]。胱天蛋白酶12凋亡信号通路是ERS独有的凋亡转导途径，有研究发现，在ERS过度状态下胱天蛋白酶12凋亡信号通路会被激活，活化形式的裂解胱天蛋白酶-12（Cl-caspase-12）和裂解胱天蛋白酶-3（Cl-caspase-3）蛋白表达水平显著升高，从而介导应激细胞凋亡[19]。本研究结果发现，异槲皮苷可促进葡萄糖调节蛋白78、CHOP和胱天蛋白酶12蛋白的表达，说明异槲皮苷可激活内质网应激途径。

研究发现，适度的ERS可通过UPR产生细胞保护作用，但当ERS持续存在或应激过度则会诱导细胞自噬和凋亡的发生[20-21]。Kassan等[22]研究发现，血管紧张素Ⅱ会诱导高血压小鼠延髓腹外侧区头端区发生ERS，p-eIF2α与ATF4-CHOP表达升高，从而导致自噬发生。本研究结果发现，异槲皮苷作用后可明显抑制Bcl-2蛋白和P62蛋白的表达，促进Beclin 1蛋白、Bax蛋白和Cl-胱天蛋白酶-3蛋白表达，LC3Ⅱ和LC3Ⅰ蛋白表达量的比值明显升高，推测异槲皮苷可能通过激活内质网应激途径，从而促进细胞自噬和凋亡的发生。Wang等[23]发现维替泊芬（Verteporfin，VP）能激活内质网应激途径，且VP处理后的宫颈癌细胞凋亡变化依赖于内质网应激途径，这与本研究结果具有一致性。

研究发现，JAK2/信号转导及转录激活蛋白3信号转导通路涉及生长、发育、肿瘤生成、炎症反应等生理和生物学作用过程[24-25]。在恶性肿瘤中JAK2/信号转导及转录激活蛋白3信号通路处于持续活化状态，JAK2与信号转导及转录激活蛋白3会发生磷酸化，活化的信号转导及转录激活蛋白3能不断进入细胞核中使其调控的下游靶基因表达失调，导致细胞异常增殖、侵袭和转移，并导致其向恶性转化[26-27]。赵林和刘四清[28]研究发现，JAK2/信号转导及转录激活蛋白3信号通道可能参与介导调节宫颈癌组织中bax、bcl-2的表达，从而达到诱导癌细胞凋亡的作用。本研究结果发现，异槲皮苷可抑制p-JAK2蛋白和p-信号转导及转录激活蛋白3蛋白表达，抑制JAK2/信号转导及转录激活蛋白3信号通路的激活，从而对细胞增殖和凋亡起到调控作用。

综上所述，异槲皮苷可通过激活内质网应激途径，进一步激活凋亡信号通路，从而诱导细胞凋亡。且异槲皮苷可通过抑制JAK2/信号转导及转录激活蛋白3信号通路对宫颈癌细胞的增殖和凋亡起到调控作用。

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（2021-12-31收稿 本文编辑：张雄杰）

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（81601259）

作者简介：蔡颖（1995.09—），女，硕士研究生在读，研究方向：妇产科学，E-mail1：559007956@qq.com

通信作者：杨英捷（1964.11—），男，博士，主任医师，研究方向：妇产科学，E-mail1：edusclt@vip.163.com