苗 宇，张浩阳，张丽佳，刘美君，王 爽

（新疆农业大学草业学院, 新疆 乌鲁木齐 830052）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是我国北方主要栽培牧草，在新疆广泛种植，是豆科牧草中耐盐性较好的牧草[1]，具有抗逆性强、耐盐、耐旱、耐风沙、抗病虫害、产量高等优点，是牛、羊等草食性牲畜的重要饲料。但新疆土壤盐渍化严重[2]，严重影响了苜蓿的生长，因此研究苜蓿的抗盐机理对苜蓿抗盐品种的选育以及苜蓿产业的发展有重要意义。

根系是植物接触土壤、吸收营养物质和水分的主要器官，根系对盐胁迫的响应是植物抗盐生理的重要研究内容。目前，关于盐胁迫对苜蓿根系伤害的研究主要集中在氧化伤害、渗透调节及细胞膜的完整性3个方面。如周万海等[3]在研究盐胁迫对苜蓿根系生长和氧化损伤中发现，盐胁迫使根系游离脯氨酸、 丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量显著上升(P＜ 0.05)，破坏了根系细胞膜的完整性。张永志等[4]研究也表明紫花苜蓿‘中苜一号’随着NaCl浓度的增加脯氨酸、MDA含量随之增加。Torabi和Halim[5]研究发现20个生态型苜蓿苗期根系脯氨酸均在盐胁迫下诱导了脯氨酸的积累，使苜蓿根系进行渗透调节。除了对氧化伤害和根系渗透调节等影响外，研究表明盐胁迫会抑制植物根系吸收其他营养物质，造成植物营养亏缺[6]，最终导致植株死亡。

植物幼苗阶段与萌发阶段最大的区别就是形成了叶片，具有积累有机物的能力，光合机构活性的高低以及叶片渗透调节能力[7]的大小可以作为评价植物叶片的耐盐性指标。王保平等[8]研究发现，随着NaCl浓度的升高，紫花苜蓿叶片脯氨酸含量增加，且碱性胁迫使苜蓿叶片积累更多的渗透调节物质。Wang和Han[9]研究结果表明，盐胁迫下两个紫花苜蓿品种的MDA含量会增加，但‘中苜一号’MDA含量较少。寇江涛等[10]和Li[11]研究均表明NaCl胁迫降低了叶片PSⅡ反应中心活性、叶绿素含量和叶片的光合速率。综上，盐胁迫会使苜蓿根系、叶片造成氧化伤害破坏其膜结构完整，渗透调节物质增加[12]、降低叶片光系统(PSⅡ)反应中心活性，限制苜蓿幼苗的生长、发育。

自2000年以来，新疆苜蓿种植面积不断扩大，但受到多种非生物因素的影响土壤盐渍化就是其中之一[13]。而新疆各类盐渍土总面积达1.62 × 106hm2[14]，且盐渍化土壤富含多种类型盐离子，严重影响苜蓿的生长，制约苜蓿产业在新疆的发展。国内外有关盐胁迫对苜蓿生长影响的研究主要集中在单盐胁迫对植物的影响，但不同种类盐胁迫下苜蓿生长是否有差异，以及混盐情况下不同盐分对苜蓿生长是否有协同或拮抗作用尚未可知。因此，本研究从单盐、混盐角度，研究了单独NaCl和KCl处理以及混盐相互作用对紫花苜蓿幼苗阶段根系和叶片光合活性的影响，以期为苜蓿耐盐品种的培育以及盐碱地苜蓿的种植推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为‘新牧4号’紫花苜蓿，由新疆农业大学草业学院提供。

1.2 试验方法

1.2.1胁迫浓度

选用长势一致的紫花苜蓿幼苗，设置4组处理。第1组：NaCl溶液浓度处理分别设为0、50、100和200 mmol·L-1；第2组：KCl溶液浓度分别设置为0、50、100和200 mmol·L-1；第3组：200 mmol·L-1NaCl + 20 mmol·L-1KCl混合；第4组：20 mmol·L-1NaCl + 200 mmol·L-1KCl混合。

1.2.2试验测定

选用直径为20 cm的花盆，并用杀菌消毒后的蛭石在25 ℃下光照培养箱中培育，紫花苜蓿长出两片子叶后按照上述盐溶液的浓度胁迫处理，胁迫处理7 d后进行生理指标的测定，根系与叶片每份样品取0.2 g，测定能反映NaCl和KCl胁迫的影响指标有根系的膜透性(相对电导率)、根系氧化胁迫(MDA含量)、根系渗透调节作用(脯氨酸含量)以及反映根系酶活性的根系活力，叶片的叶绿素含量和脯氨酸含量。

将处理后的幼苗分别放入光照培养箱内进行光照处理，分别在0 和4 h后测定叶片的最大光化学效率(maximum photochemical efficiency，Fv/Fm)[15]。

1.2.3指标测定方法

相对电导率：是反映植物细胞膜透性的生理指标，值越大说明细胞在胁迫的环境下受到的伤害越大，采用浸泡法测定[16]。

MDA含量：是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，MDA的产生能加剧膜的损伤，采用硫代巴比妥酸法测定[17]。

脯氨酸含量：是植物蛋白质的组分之一，植物在逆境条件下，会使脯氨酸大量累积，作为渗透调节物质来提高植物的抗逆性。采用酸性茚三酮比色法测定脯氨酸含量[18]。

根系活力：采用TTC法测定根系活力[19]。

叶绿素含量：采用无水乙醇浸提法测定[20]。

Fv/Fm：采用FluorPen FP 110手持式叶绿素荧光仪测定。

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0统计分析，对同浓度下不同盐处理用t检验分析，不同浓度盐处理、同一盐处理后不同时间光照间进行单因素方差分析，并用Duncan法对测定数据进行多重比较；采用Excel 2019制图。

2 结果与分析

2.1 不同胁迫对幼苗根系的影响

2.1.1不同胁迫对幼苗根系细胞膜完整度的影响

在50、100、200 mmol·L-1KCl处理下紫花苜蓿根系相对电导率显著大于NaCl处理(P＜ 0.05) (图1A)。在200 mmol·L-1NaCl加入20 mmol·L-1的KCl相对电导率显著高于200 mmol·L NaCl (P＜ 0.05)，提升了9.46%。而在200 mmol·L-1KCl下加入20 mmol·L-1NaCl相对电导率显著低于200 mmol·L-1KCl (P＜0.05)，降低了5.80%。后者相对电导率降低，对紫花苜蓿的细胞膜的伤害程度减小(图1B)。相对电导率的变化也显示，两组混盐相比较，200 mmol·L-1KCl + 20 mmol·L-1NaCl显著升高(P＜ 0.05)，变化为正值。这说明少量Na+能缓解紫花苜蓿幼苗在KCl胁迫下根系细胞膜的完整度。

图1 不同盐胁迫后紫花苜蓿根系电导率Figure 1 Electrical conductivity of alfalfa root system after different salt stress treatments

2.1.2不同胁迫下幼苗根系细胞的氧化伤害

NaCl和KCl在CK、50 mmol·L-1时，根系MDA的含量无显著差异(P＞ 0.05)，此后随盐浓度升高，MDA含量升高，且相同浓度下KCl处理显著大于NaCl (P＜ 0.05) (图2A)。当在200 mmol·L-1KCl中加入20 mmol·L-1的NaCl显著降低了MDA含量(P＜ 0.05)，但在200 mmol·L-1NaCl中加入20 mmol·L-1的KCl增加了MDA的含量(图2B)，这说明少量NaCl缓解了KCl胁迫对苜蓿根系造成的氧化伤害，从而降低了根系细胞膜脂过氧化程度。

图2 不同盐胁迫后紫花苜蓿根系丙二醛含量Figure 2 Malondialdehyde content of alfalfa roots after different salt stress treatments

2.1.3不同胁迫下幼苗根系细胞渗透调节作用

随着盐浓度的增加，根系脯氨酸含量逐渐上升，说明盐胁迫导致细胞内的离子失调，细胞产生了渗透调节物质脯氨酸。除了CK外，在相同盐浓度下比较，KCl胁迫脯氨酸含量显著大于NaCl胁迫(P＜ 0.05)，这也就说明KCl导致的离子失衡更严重(图3A)。在200 mmol·L-1NaCl加 入20 mmol·L-1的KCl相比于单盐NaCl脯氨酸含量没有显著上升(P＞ 0.05)，但当在200 mmol·L-1KCl中加入20 mmol·L-1的NaCl使脯氨酸含量相比与单盐KCl显著升高(P＜ 0.05) (图3B)。这表明混盐使根系细胞的离子失调程度更大，并且少量的Na+可以促进在大量KCl胁迫下的渗透调节物质的生成，以更好地抵抗离子失调。

图3 不同盐胁迫后紫花苜蓿根系脯氨酸含量Figure 3 Proline content of alfalfa root system after different salt stress treatments

2.1.4不同胁迫对幼苗根系活力的影响

根系活力随盐浓度的上升而下降(图4A)，即根细胞的酶活性随盐浓度升高而下降，使得细胞内氢的含量上升，对细胞而言又是一种伤害。高浓度KCl下根系活力低于NaCl胁迫，但不显著(P＞ 0.05)。混盐均可使根系活力上升，且混盐均显著高于相对应的单盐(P＜ 0.05) (图4B)。通过对比两种不同的混盐根系活力发现，在200 mmol·L-1的KCl加入20 mmol·L-1NaCl根系活力显著(P＜ 0.05)高于200 mmol·L-1NaCl处 理 中 加 入20 mmol·L-1KCl，200 mmol·L-1KCl + 20 mmol·L-1NaCl和200 mmol·L-1NaCl + 20 mmol·L-1KCl与单盐KCl和单盐NaCl处理相比，分别上升了46.05%、23.57%。说明在大量的KCl中加入少量NaCl对根系活力的影响更大，其根系活力明显增加、细胞内的酶活性显著提高(P＜ 0.05)。

图4 不同盐胁迫后紫花苜蓿根系活力Figure 4 Root vigor of alfalfa after different salt stress treatments

2.2 不同盐胁迫对幼苗叶片色素的影响

紫花苜蓿叶绿素含量、叶绿素a、叶绿素b均随着盐浓度的升高呈先上升后下降的趋势。叶绿素总含量在NaCl胁迫下50 mmol·L-1的盐浓度时达到最大值，这可能是低浓度的盐促进了叶绿素的形成(图5A)。对比KCl和NaCl胁迫，发现叶绿素a在浓度梯度下均无显著差异(P＞ 0.05)，叶绿素与叶绿素b含量在50 和200 mmol·L-1的两盐处理下有显著差异(P＜ 0.05)，KCl紫花苜蓿叶绿素的含量明显下降，且小于NaCl胁迫。

图5 不同胁迫后紫花苜蓿各叶绿素含量的变化Figure 5 Changes in the chlorophyll content of alfalfa after different treatments

在200 mmol·L-1的KCl和NaCl中分别加入20 mmol·L-1的NaCl和KCl可发现其叶绿素含量均有所升高(图6)，但在200 mmol·L-1的KCl中加入20 mmol·L-1NaCl其叶绿素总含量显著高于200 mmol·L-1的KCl (P＜ 0.05)，其变化也最大，也就说明缓解效果更好。

图6 混盐胁迫后紫花苜蓿叶绿素含量的变化Figure 6 Changes in the chlorophyll content of alfalfa after mixed salt stress

KCl胁迫与NaCl胁迫叶片类胡萝卜素含量在50 mmol·L-1时有显著差异(P＜ 0.05) (图7A)，但其他浓度差异不显著(P＞ 0.05)。两组混盐处理均增加了类胡萝卜素含量，且加入少量NaCl处理的增加显著大于单盐KCl，提升了16.06% (P＜ 0.05)。(图7B)。这 说 明200 mmol·L-1KCl + 20 mmol·L-1NaCl处理组使胡萝卜素淬灭过剩光能的功能得到了提升。

图7 不同盐胁迫后紫花苜蓿类胡萝卜素含量的变化Figure 7 Carotenoid content of alfalfa after differentsalt stress treatments

2.3 不同盐胁迫对幼苗叶片最大光化学效率的影响

与黑暗条件相比，光照4 h使得最大光化学效率显著下降(P＜ 0.05)，说明叶片在强光下产生了光抑制。当在高浓度KCl和NaCl中分别加入20 mmol·L-1NaCl和20 mmol·L-1KCl时，Fv/Fm无显著变化(图8)。4 h的强光处理下在200 mmol·L-1KCl+20 mmol·L-1NaCl和200 mmol·L-1NaCl+20 mmol·L-1KCl与单盐KCl和单盐NaCl相比，Fv/Fm分别提升了0.54%和降低了6.70%。故少量NaCl更能够缓解苜蓿在高浓度KCl胁迫后强光照射产生的PSⅡ的光抑制。

图8 不同盐胁迫后紫花苜蓿Fv/Fm的变化Figure 8 Changes in Fv/Fm of alfalfa after different salt stress treatments

2.4 不同盐胁迫对幼苗叶片渗透调节物质的影响

叶片脯氨酸含量在盐浓度100 和200 mmol·L-1下有显著差异(P＜ 0.05)，即KCl处理使叶片产生更多的渗透调节物质(图9A)。加入少量的NaCl和KCl都会使200 mmol·L-1的KCl和NaCl的叶片脯氨酸含量下降，但在200 mmol·L-1的NaCl中加入少量的KCl的下降量并不显著(P＞ 0.05)，下降了8.30%。而200 mmol·L-1KCl中加入少量的NaCl相比与单盐KCl显著下降了9.04% (P＜ 0.05) (图9B)。即少量的NaCl更能减轻叶片高KCl的渗透胁迫。

图9 不同盐胁迫后紫花苜蓿叶片脯氨酸含量Figure 9 Proline content of alfalfa leaves after different salt stress treatments

3 讨论

植物根系是最早感知外界盐浓度的器官，是吸收水分和矿质离子的最主要的部位。盐胁迫通过抑制植物的根长、根系活力等影响植物的生长[21]。本研究发现，紫花苜蓿根系活力随着盐浓度的上升根系活力随之下降并且K+的伤害程度大于Na+，其原因可能是植物中K+比Na+利用程度大[22]。这一结果在其他植物上也得到验证[23-24]。在对甜菜(Beta vulgaris)的研究上认为，植物利用K+的程度大于Na+且KCl对甜菜生长及根系的伤害更大[25]。Wang等[26]研究发现，随着盐浓度的增加和胁迫时间延长，秋茄(Kandelia obovata)根中MDA含量等随着盐浓度的增加呈上升趋势。当植物处于盐胁迫下根系细胞吸收大量盐离子导致细胞中大量积累盐离子打破原有的Na+/K+平衡，破坏植物维持细胞内外的离子平衡，最终影响植物的整个代谢[27]。本研究发现，少量的Na+减轻了大量K+的伤害，保持了膜的完整性，维持了根系细胞内的渗透平衡及根系的正常生长。这可能是植物细胞内的钠钾泵在离子平衡中起重要作用，消耗腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)分子，维持细胞的静息电位。

与根系相比，KCl胁迫同样比NaCl对叶片的伤害大[28-29]，房朋等[30]研究指出，Na+的亏缺和高浓度K+的积聚可能是导致高浓度KCl对杂交酸模光合活性的伤害比NaCl更严重的主要原因。而王宝山等[31]认为，叶片中KCl造成的伤害大于NaCl的原因是KCl破坏了Ca+的吸收。与根系不同的是不同配比的混盐对盐胁迫对叶片的伤害均有缓解作用，且少量的NaCl对过量KCl的缓解作用更大。这与熊雪等[32]的试验结论相似。当苜蓿受到盐胁迫时，叶片受到氧化伤害、渗透调节物质上升、叶片的叶绿素被降解[33-34]。本研究结果表明，单盐处理时MDA、脯氨酸、叶绿素随着盐浓度升高而升高，K+和Na+混合胁迫下，植物对Na+的吸收，抑制了K+的积累，缓解了叶片受到的伤害。值得注意的是，目前盐胁迫对叶绿素含量的影响并不统一，但就本研究来说，低浓度单盐胁迫时，叶绿素含量升高其原因可能是由于低盐促使细胞积累脯氨酸而脯氨酸的积累有利于叶绿素的合成[35](图5)。此外，当植物受到盐胁迫时，体内会产生保护酶和非酶促的防御系统[36]，类胡萝卜素就是其中的还原性物质，而本研究单盐处理时类胡萝卜素含量先下降后升高、混盐处理下少量NaCl缓解KCl胁迫可能也与它的保护性有关。Fv/Fm反映了叶片PSⅡ的最大光化学效率[37]，在盐胁迫下PSⅡ的变化能反映出盐胁迫对光合作用的影响。少量NaCl能够缓解在植物受到高浓度KCl胁迫后强光照射产生的光抑制，使得Fv/Fm升高，这可能是由于少量的NaCl维持了离子平衡，使得KCl胁迫对紫花苜蓿光合作用影响降低。

本研究表明，高浓度的K+使得苜蓿细胞内离子平衡失衡而加入少量Na+能维持离子平衡，使得大量的K+离开细胞，进而使得脯氨酸等渗透调节物质含量降低，减少KCl胁迫对紫花苜蓿的伤害。但也有研究指出K+的施用也能减轻Na+的胁迫，如Mehreen[38]研究表明适度提高小麦(Triticum aestivum)幼苗的K+施用量可以降低组织和细胞内Na+浓度，并通过减轻Na+毒害的有害影响提高小麦生长和产量。本研究强调了在相同浓度NaCl和KCl水平下，Na+及K+配施对苜蓿幼苗叶片和根系的影响，为苜蓿在盐渍化土地上的种植提供理论指导。

4 结论

综上所述，盐胁迫破坏了幼苗根系膜的完整性、限制了叶片的光合效率，最终影响紫花苜蓿的生长发育且KCl伤害大于NaCl。补加低浓度的NaCl减轻了高浓度的KCl对细胞产生的渗透胁迫，减缓了细胞的氧化伤害，从而减轻了对膜完整性以及光合机构的伤害，缓解了KCl对紫花苜蓿的生长发育的影响。