付兴前 郭礼跃 欧梁 孔德忠 龙刚 杨先宇

摘要 目的：基于數据挖掘和网络药理学探讨治疗肝肾亏虚型膝骨关节炎的用药规律及其作用机制。方法：通过检索国家知识基础设施数据库（CNKI）近10年治疗肝肾亏虚型膝骨关节炎的方剂，运用中医传承辅助平台建立数据库，利用该软件的熵聚类等算法，总结出治疗肝肾亏虚型膝骨关节炎方剂中的用药频率、核心组合、核心药物模式及归经频率以及得出新方组合。再运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、基因表达综合（GEO）、STRING、Metascape等数据库及Cytoscape软件对其核心药物靶点与差异表达基因交集进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）、京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析，并构建药物-成分-靶点关系网络图。结果：筛选符合纳入标准的72首方剂所含药物进行频次统计分析，得出频次≥10次的药物有25味，其中使用频次较高的有牛膝、当归、熟地黄;药物的归经以肝、肾、脾经为主;通过系统熵聚类的层次聚类分析挖掘出核心组合药物16个及新处方8首;对核心药物牛膝、当归与熟地黄进行网络药理学分析得到槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇等关键活性成分及靶点176个;膝骨关节炎差异表达基因258个;核心Hub基因为IL-6、MMP9、CXCL8、JUN、VEGFA;KEGG富集分析主要在IL-17、TNF、Toll样受体、核因子κB等信号通路上。结论：治疗肝肾亏虚型膝骨关节炎以补益肝肾、通络止痛为主，其机制可能通过作用IL-6、MMP9等靶点及对IL-17、TNF、Toll样受体、核因子κB等复杂通路的共同干预实现。

关键词 膝骨关节炎;网络药理学;数据挖掘;肝肾亏虚;用药规律;通路;靶点;机制

Analysis of Medication Rule and Mechanism of Knee Osteoarthritis with Liver and Kidney Deficiency Based on Data Mining and Network Pharmacology

FU Xingqian1，GUO Liyue2，OU Liang2，KONG Dezhong1，LONG Gang1，YANG Xianyu1

（ College of Orthopaedics and Traumatology，Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China; 2 The First Department of Orthopedics，The Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550003，China）

Abstract Objective：To explore the medication rule and mechanism of Chinese medicine prescriptions in the treatment of knee osteoarthritis with liver and kidney deficiency based on data mining and network pharmacology.Methods：China National Knowledge Infrastructure（CNKI） was searched for the prescriptions for the treatment of knee osteoarthritis with liver and kidney deficiency in the last 10 years.Traditional Chinese Medicine Inheritance Support System was used to establish a database and its entropy clustering algorithm was adopted to summarize the drug frequency，core combination，core drug mode and meridian frequency of the prescriptions for the treatment of knee osteoarthritis with liver and kidney deficiency，and to obtain the new prescription combination.Then Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），Gene Expression Omnibus（GEO），STRING and Metascape as well as Cytoscape were employed for the intersection of core drug targets and differentially expressed genes and the construction of protein-protein interaction（PPI） network.Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analysis was performed and the drug-component-target network diagram was established.Results：A total of 72 prescriptions that met the inclusion criteria were selected for frequency statistical analysis.It was found that there were 25 Chinese medicinal materials with frequency≥10，among which Radix Achyranthis Bidentatae，Radix Angelicae Sinensis and Radix Rehmanniae Preparata were used more frequently，and they belonged to the liver，kidney and spleen meridians.Sixteen core combination drugs and 8 new prescriptions were excavated by hierarchical cluster analysis of entropy clustering.The network pharmacological analysis of the core Chinese medicinal materials Radix Achyranthis Bidentatae，Radix Angelicae Sinensis and Radix Rehmanniae Preparata showed that there were 176 key active components and targets，such as quercetin，stigmasterol and β-sitosterol，and 258 differentially expressed genes of knee osteoarthritis.The core Hub genes were mainly IL-6，MMP9，CXCL8，JUN and VEGFA in IL-17，TNF，Toll-like receptor and NF-κB signaling pathways based on KEGG enrichment analysis.Conclusion：The treatment of knee osteoarthritis with liver and kidney deficiency focuses on tonifying and replenishing the liver and kidney，dredging collaterals and relieving pain.The mechanism may be achieved by acting on IL-6，MMP9 and other targets and regulating the complex pathways such as IL-17，TNF，Toll-like receptor and NF-κB signaling pathways.

Keywords Knee osteoarthritis; Network pharmacology; Data mining; Liver and kidney deficiency; Medication rule; Pathway; Target; Mechanism

中图分类号：R274文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.05.024

骨性关节炎是一种关节退行性疾病，以关节软骨丢失为特征[1]，影响着全球约2.5亿人[2]，由于肥胖症和人口老龄化的增加，膝关节骨性关节炎（Knee Osteoarthritis，KOA）的患病率也正在攀升[3]。此外，它是成年人中最常见的致残疾病之一[4]。最常见的临床症状为关节僵硬、慢性疼痛、功能受限[5]，其病理改变主要为关节软骨局灶性丢失、软骨下骨改建和骨赘形成[6]。KOA与许多致病因素有关，包括肥胖、遗传、衰老、创伤等，但其发病机制尚未完全明确。西医治疗KOA主要是通过使用非甾体抗炎药、阿片类药物和类固醇药物来缓解[7]，但由于西药的不良反应、手术创伤及费用高昂、术后康复等问题，中医药治疗KOA越来越受到关注[8]。骨关节炎不仅会导致严重的疼痛和功能障碍，还会给医疗系统带来负担[9]。有研究还表明，中医药治疗KOA疗效显著、不良反应少、治疗方法多[10]。因此研究出一种安全、有效和廉价的中医药防治KOA的方法具有重要的临床意义。本研究收集整理国家知识基础设施数据库（China China National Knowledge Infrastructure，CNKI）近10年中医药治疗肝肾亏虚证KOA的临床研究文献，并对其用药规律和潜在作用成分、核心Hub基因与信号通路进行了分析，为今后KOA肝肾亏虚证的防治研究及其药理研究提供理论参考依据。

资料与方法

1. 处方来源

2011年1月至2020年11月期间，以“膝骨关节炎”“肝肾亏虚”“中药”等为检索词在CNKI进行检索，严格按照处方纳入标准以及剔除标准，通过阅读文献摘要及通览全文，最终得到符合纳入标准的72篇文献。

1.2 筛选处方

1.2. 纳入标准 1）选择使用中药煎剂治疗肝肾亏虚型膝骨关节炎的文献，可联合其他中西医治疗方法，包括病案分析、临床疗效观察、专家经验方等;2）药物剂量及名称明确。

1.2.2 剔除标准 1）除了汤剂之外的剂型，例如丸散、熏洗、外敷、胶囊、膏剂等剂型;2）中药剂量缺失;3）方剂重复;4）方剂组成不完整;5）证型错杂;6）综述类文献;7）动物实验。

1.3 中药名称规范 参考《中华人民共和国药典》[11]2015年版和人民卫生出版社第二版《中药学》[12]，将涉及的中药名称进行标准化统一规范，如“川牛膝、怀牛膝”规范为“牛膝”“炙甘草”规范为“甘草”“川续断”规范为“续断”“仙灵脾”规范为“淫羊藿”等。

1.4 统计学分析 利用“中医传承辅助平台”（V2.5）进行数据分析，把筛选出的处方录入系统，由2人对录入数据进行核对并保证其结果的准确性。运用系统中“数据分析”模块进行统计学分析：1）中药及归经频率分析，2）组方规律分析：药物模式-网络展示-规则分析，3）提取新方组合。

1.5 分子作用機制分析 将组方规则分析获取的核心药物模式利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）对活性组分和潜在作用靶点进行筛选。采用口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18的标准进行活性成分筛选。将获取到的靶点蛋白输入Uniprot（http：//www.uniprot.org/）数据库中转换为靶点的基因名称，删除重复后获得潜在靶基因，利用Cytoscape 3.7.2软件构建药物-活性成分-靶点可视化网络图。利用基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获取KOA的基因芯片。从GEO数据库下载编号为GSE55235、GSE46750的基因芯片数据原始文件。GSE55235芯片包括10个非感染性滑膜组织和10个正常滑膜组织，平台为GPL96[HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A Array;GSE46750芯片包括12个非感染性滑膜组织和12个正常滑膜组织，平台为GPL10558 Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip。利用P<0.05和LogFC绝对值≥2为条件筛选差异表达基因（LogFC≤-2为下调基因，LogFC≥2为上调基因）。将获取的药物靶点与KOA差异表达基因进行匹配映射，并利用Venny2.1在线平台绘制韦恩图。将疾病与药物共同靶点输入STRING11.0（https：//string-db.org/cgi/input.pl）数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络图。下载PPI网络tsv文件导入Cytoscape 3.7.2软件中，利用CytoHubba插件MCC算法设置分析前5的靶点。最后运用Metascape数据库（http：//metascape.org/gp/index.html）对交集基因进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并借助bioinformatics在线工具（http：//www.bioinformatics.com.cn）绘制KEGG富集气泡图及差异表达基因火山图。

2 结果

2. 用药频率及归经频率分析

对治疗膝骨关节炎肝肾亏虚型的72首处方进行用药频率统计分析，其中使用频率≥10次的药物有25味，位居第一位的为牛膝。见表1。归经统计见图1。药物出现频率前10位统计见图2。

2.2 基于关联规则的处方规律分析

2.2. 将支持度设置为26、置信度为0.8时核心药物模式频度第一为牛膝与熟地黄、牛膝与当归。见表2。网络化展示见图3。

2.2.2 设置支持度为26，置信度大于0.800时药物的关联规则见表3。

2.3 基于无监督的熵聚类的处方规律分析

2.3. 基于复杂系统熵聚类的层次聚类分析，衍化得到16种核心组合。见表4。

2.3.2 使用无监督熵层次聚类算法，设置相关度为8，惩罚度为2，衍化得到8个治疗肝肾亏虚型KOA的新处方。见表5。新方网络化展示见图4。

2.4 核心药物模式“牛膝、当归、熟地黄”抗膝骨关节炎的作用机制分析

2.4. 牛膝、当归、熟地黄活性成分及靶点筛选   通过筛选，得到24种活性成分。24种化合物在TCMSP数据库中预测得到潜在靶蛋白547个，构建药物-成分-靶点网络图。见图5。根据网络Degree值结果，位居前3的成分依次为槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇。

2.4.2 膝骨关节炎差异表达基因获取 共获得109个上调基因和149个下调基因。绘制火山图见图6。

2.4.3 构建PPI网络

获取的药物靶点与KOA差异表达基因匹配映射绘制韦恩图，得到药物-KOA共同靶点19个。见图7。将交集基因输入至STRING11.0数据库，得到PPI网络图，网络图中隐藏2个断开连接的蛋白。见图8。设置分析前5的靶点。见图9。

2.4.4 KEGG通路富集分析 通路富集分析得到103个信号通路，主要涉及IL-17、TNF、Toll样受体、核因子κB等信号通路。见图10。

3 讨论

我国骨关节炎患病率大约为3%，其中KOA占据大部分[13]。中医学将KOA纳入“骨痹”“膝痹”“厉节”等范畴[14]。中医学认为，其发病机制为患者年老体衰，导致肝血不足、肾精亏虚，而肝主筋、肾主骨生髓，筋骨失于濡养，故气血运行不畅，络脉瘀阻，不通则痛，发为本病。治疗宜滋补肝肾、通络止痛为主，祛风除湿为辅，标本兼治。何名江等[15]研究发现滋补肝肾，祛风除湿中药可有效减低血清中TNF-α及IL-1β水平，而膝关节局部滑膜炎症反应也会被有效抑制。袁芳等[16]指出KOA的发病本源是肝肾亏虚，而患者的发病率与体质及发病年龄正相关。利用中医传承辅助平台与网络药理学分析相结合的方法，可以从宏观层面与微观层面挖掘中医方剂用药规律和可能机制，为临床治疗KOA和相关证候提供数据支持。

从宏观层面看，本研究以KOA肝肾亏虚证为研究对象，通过收集CNKI近10年的相关文献72篇，运用中医传承辅助平台的数据挖掘功能、统计分析功能，总结出治疗肝肾亏虚型KOA的用药规律，挖掘出新方。通过药物使用频率进行统计分析，药物出现频率最高的为牛膝，牛膝性味苦酸甘平，归肝脾经，有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经、引血下行等功效。现代药理学研究发现，牛膝含有甾酮类（β-谷甾醇、豆甾醇）、多糖类等化合物，具有抗炎、增强免疫力、抗骨质疏松等作用[17]。药物的归经频率位居前3的分别为肝、肾、脾经。本病病位在膝关节，也是肝、肾、脾经的经络循行部位，可见历代医家在治疗KOA時依据经络的循行原则进行选择药物。孙志涛和牛维[18]研究发现在治疗“骨痹”的用药规律中，归肝、肾、脾经的药物使用频率较高，并且治疗KOA的主线应以补肝肾、强筋骨为主。在核心药物组合模式频度分析中，组合频度前3依次为“牛膝-当归”“熟地黄-牛膝”“牛膝-杜仲”。由此可见，以上药物组合大多以滋补肝肾、强壮筋骨、止痹痛、补气血为主，其用药组合与肝肾亏虚型KOA的病因病机高度吻合。因此，以补肝益肾、止痹痛与补气血的药物治疗肝肾亏虚型KOA具有很好的临床疗效。在核心组合药物的基础上，通过进一步复杂系统熵聚类的层次聚类分析，衍化出新处方8首。比如新处方8（桑寄生、川芎、秦艽、党参、细辛、人参）中的药物与出自《备急千金要方》中记载的独活寄生汤的组成相似，以奏补肝肾、止痹通、益气血之功;桑寄生功擅补益肝肾;秦艽、川芎、细辛功擅止痹痛;人参、党参功擅健脾养血。可见通过数据挖掘统计分析得出的方剂配伍规律与古代医家治疗KOA肝肾亏虚型的经方临床经验非常相似，这对我们的临床工作者在疾病的诊断和治疗中有很大的益处。

从微观层面看，由药物-化合物-靶点网络图可知，牛膝-当归-熟地黄中24个活性化合物作用于176个靶点，说明中药治疗KOA具有多成分、多靶点的特点。本研究的成分靶点网络拓扑分析结果显示Degree值位居前3的为槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇，说明它们可能是治疗KOA的关键活性成分。有研究表明，槲皮素具有抗炎、清除氧自由基和抗氧化应激的作用，它可以抑制核因子κB信号通路和细胞外基质，激活核因子E 2相关因子2，减少炎症介质的形成，从而延缓关节炎的病程[19]。Gabay等[20]研究发现，豆甾醇具有潜在的抗炎和抗分解代谢特性，它至少部分通过抑制核因子κB通路，抑制参与软骨降解的金属蛋白酶的表达，同时抑制炎症介质PGE 2的作用。β-谷甾醇的抗炎作用是通过抑制核因子κB和STAT1信号转导途径实现的[21]。

通过PPI网络分析发现，牛膝、当归、熟地黄防治KOA的核心Hub基因前5的依次为IL-6、MMP9、CXCL8、JUN、VEGFA。先前的研究表明，炎症反应中的重要炎症介质是IL-6，与关节中软骨基质的降解和滑膜的破坏有关[22]。MMP9属于金属蛋白酶的亚型[23]，FP-MD能在转录水平有效抑制膝关节炎症组织中基质金属蛋白酶（MMPs）的表达[24]。CXCL8是最早也是研究最深入的趋化因子之一，作为一种促炎趋化因子发挥作用，且CXCL8-CXCR1/2轴在关节炎等炎症性疾病中的病理生理学作用已被证实[25]。JUN是激活蛋白1的转录因子，介导分解代谢转录和细胞凋亡或死亡，并在IL-17与TNF信号通路中发挥重要作用[26]。VEGF-A是血管内皮生长因子家族的成员，在骨性关节炎的发病机制中，VEGF-A是研究最广泛的，它在维持软骨内成骨中起重要作用，将成为防治骨性关节炎的潜在靶点[27]。

靶基因的KEGG通路富集分析揭示了药物活性成分主要通过炎症相关通路发挥调节KOA的作用。IL-17信号激活炎性转录因子，通过核因子κB和MAPK通路诱导基因表达[28]。TNF-α是一种多能细胞因子，介导广泛的促炎活性，经刺激后，可以激活核因子κB、MAPK等通路[29]。Toll样受体（Toll-like Receptors，TLR）存在于关节软骨中，并且已知在关节炎软骨中表达上调[30]。研究还表明，TLR4信号转导通路是促炎反应的主要介质，剪切力的持续时间能够以脂质运载蛋白L型前列腺素依赖的方式调节TLR4的激活和随之而来的细胞衰老、死亡和凋亡[31]。核因子κB介导软骨细胞和滑膜细胞中的滑膜炎引起的TLR和晚期糖基化终末产物（AGE）受体的信号转导，导致ADAMT、MMP、炎症介质和活性氧的表达增加[32]。

综上所述，本研究基于辨证为肝肾亏虚型KOA的基础上，采用数据挖掘结合网络药理学方法，分析了临床治疗KOA肝肾亏虚证的用药规律和牛膝、当归与熟地黄3味中药可能作用的活性成分、核心Hub基因与信号通路，进一步为中医药治疗KOA肝肾亏虚证的用藥规律及作用机制提供了新的参考。中医传承辅助平台与网络药理学属于数据挖掘类研究，其研究结果主要基于现有的研究成果以及对活性成分、信号通路、靶点等的预测分析，因此研究结果与临床和动物实验存在一定的差异，这需要在未来进一步证实[33]，为中医药的临床应用开辟更广阔的前景，为KOA提供更精准的靶向治疗。

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（2021-02-25收稿 本文编辑：吴珊）