张业森，尚毓淳，姜之全，苏贺先，赵永轩

(蚌埠医学院第一附属医院神经外科，安徽 蚌埠 233004)

急性颅脑损伤后脑挫裂伤周边会形成一个局部脑血流下降的缺血半暗带，这种局部缺血缺氧的脑组织面积是脑挫裂伤面积的数倍，脑内出血压迫致血管活性物质异常增多，挫裂伤周边进行性细胞坏死是神经功能进行性恶化的主要原因[1]，并且脑缺血引起的脑外伤相关损伤很显著[2]。急性颅脑损伤治疗效果确不令人满意，其原因可能是没有深入探讨急性缺血缺氧损伤是如何影响细胞器功能及没有提出针对性细胞保护措施有关，因此深入细胞及细胞器层面探究并阐明急性缺血缺氧损伤的发生机制，对提出更为有效的防治措施有重要的临床意义，目前国内外很多研究聚焦缺血缺氧损伤的治疗方法[3-4]。本实验将体外缺氧复氧神经元细胞模拟颅脑损伤中缺血缺氧损伤的神经元细胞[5]，研究外源性血管内皮生长因子(VEGF)对缺氧复氧神经元细胞的保护作用，为颅脑损伤后缺氧复氧神经元的保护提供新的治疗方法。

1 材料与仪器

1.1 实验细胞 HT22细胞系购于普诺赛生物有限公司。

1.2 实验试剂与仪器 DMEM高糖培养基(KGM-12800S，凯基生物)；DMEM无糖基础培养基(2217-367，Gibco)；VEGF 164 (50159-MNAB，Sino Bioiogical)；Hoechst 33342染色液(C1026，Beyotime)；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit(AP101-100-kit，MULTI SCIENCES 联科生物)；RIPA细胞裂解液(C1053，北京普利莱基因技术有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit)(E-BC-K318-M，Elabscience)；Mouse Monoclonal Anti-Actin(TA-09，中杉金桥，1/2000)；辣根酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)(ZB-2305，中杉金桥，1/2000)；Rabbit Anti Drp1(12957-1-ap，Proteintech，1/500)；辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(ZB-2301，中杉金桥，1/2000)；三气培养箱(YCP-100S，长沙华曦电子科技有限公司)；光学相差显微镜(日本 OLYMPUS公司)；荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；DYY-7B型稳压稳流电泳仪(美国 Bio-Rad公司)；垂直电泳槽(美国伯乐公司)；转移电泳槽(美国伯乐公司)；转膜仪(美国 Hoefer 公司)。

1.3 HT22细胞培养 HT22细胞用含有10%胎牛血清与1%青链霉素混合液的高糖DMEM培养基并置于CO2培养箱(37 ℃，5%CO2，饱和湿度)中进行培养。

1.4 HT22细胞缺氧复氧模型的建立 取对数生长期的HT22细胞，随机分成3组：正常对照组(Control)、缺氧复氧组(Model)、Model+VEGF 164组(Model+VEGF)。除正常对照组外，其余各组细胞均进行氧糖剥夺6 h处理后，进行复氧复糖培养18 h处理，建立缺氧复氧细胞模型：弃去正常细胞培养基，PBS润洗细胞后(2次后)，DMEM无糖培养基加入培养皿，然后放入含94%N2+5%CO2+1%O2的37 ℃三气培养箱中培养6 h后，将无糖DMEM培养基更换为正常培养基，放入37 ℃ 5%CO2培养箱中继续培养18 h；Model+VEGF组细胞在复氧复糖18 h后，加入VEGF 164( 终浓度为25 μg/L)继续培养24 h后，观察细胞形态变化并进行相应检测。

1.5 Hoechst 33258染色 细胞固定15 min后，适当洗涤去除固定剂；Hoechst 33342染色液覆盖样本；室温放置5 min；PBS充分洗涤。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集1×106～3×106个细胞，加1 ml PBS 1 500 r/min离心，3 min，洗两遍；用双蒸水将5×Binding Buffer 稀释为1×Binding Buffer；取300 μl预冷的1×Binding Buffer 重悬细胞；每管各加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI；轻微混匀后，室温避光孵育10 min ；再向每管中加入200 μl预冷的1×Binding Buffer。混匀后上流式仪检测。

1.7 Western blot检测 将3组细胞分别加入裂解液，在冰上裂解30 min后，4 ℃，离心机上离心10 min(10 000 r/min)，轻轻吸取上清液，即为提取的总蛋白。利用BCA试剂盒测定蛋白浓度。首先蛋白变性，再上样，凝胶电泳2 h，后湿法转膜30 min。一抗溶液孵育，4 ℃冰箱过夜；二抗溶液在室温下摇晃孵育1 h。将ECL曝光液滴加在膜上，通过凝胶成像系统曝光。用“Quantity one”软件分析各抗体条带灰度值。

2 实验结果

2.1 倒置显微镜下观察缺氧复氧HT22细胞的形态变化 倒置显微镜下观察结果，如图1所示，Control组细胞贴壁生长，细胞呈两级或多级，胞体明显，细胞更为短小与饱满，细胞交织成片连接在一起；与Control组相比，Model组细胞皱缩，胞体变圆，细胞显微镜下观察细胞突触变长，细胞间连接减少；与Model组相比，Model+VGEF组细胞形态大部分与Control组细胞形态相近，细胞间连接有所增多。

图1 光学显微镜下各组细胞形态学观察(100×)

2.2 Hoechst 33258染色结果与流式细胞术检测细胞凋亡结果 Hoechst 33258染色观察不同组别的HT22细胞核形态变化。如图2A所示，Control组大部分细胞的细胞核呈卵圆型，染色质均匀分布；Model组细胞染色质碎裂、固缩，形态异常细胞核数目增多；与Model组相比，Model+VGEF组形态异常的细胞核数目有所减少。流式细胞术检测各组细胞凋亡情况，结果如图2B所示，与Control组相比，Model组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与Model组相比，Model+VEGF组细胞凋亡显著降低(P<0.05)。

注：A：Hoechst 33258 染色结果；B：流式细胞术检测凋亡结果。与Control组相比，*P<0.05；与Model组相比，#P<0.05。

2.3 Western blot检测结果 如图3所示，与Control组相比，Model组与Model+VEGF组细胞中Drp1蛋白表达量显著增加(P<0.05)；与Model组相比，Model+VEGF组细胞中Drp1蛋白表达量明显下降(P<0.05)。

注：*P<0.05。

3 讨论

VEGF 在中枢神经系统中以改善血管通透性、促进血管生成发挥生物学作用，VEGF 广泛存在于脑内血管内皮上，调节脑循环和血脑屏障，在中枢神经系统内作为细胞保护因子，对脑缺血及脑缺氧损伤起保护作用，预防及治疗脑血管疾病、神经变性。在大鼠脑缺血-再灌注区注入VEGF重组质粒，神经元损伤及水肿明显减轻，表明VEGF对脑缺血损伤可能起到重要的保护作用[6]。

本研究中外源性VEGF加入缺氧复氧神经元细胞后细胞核Hoechst 33258染色提示缺氧复氧的神经元细胞核破裂减少，且流式检测细胞的凋亡率有明显的降低，说明外源性VEGF对神经元细胞具有抗凋亡作用。并且发现神经元细胞在缺氧复氧后Drp1有明显增加，但是加入VEGF后缺氧复氧神经元细胞中Drp1明显降低。Drp1是一种维持细胞器结构很重要的保守蛋白，是线粒体动力学的重要调节因子，Drp1存在于细胞质中，被招募到线粒体膜外部介导分裂[7]。该蛋白的突变被报道与神经退行性变、癌症和心血管疾病的发生有关[8]，而且选择性抑制Drp1聚集导致其能伸长细胞线粒体与抑制细胞凋亡[9]。

研究显示线粒体的凋亡首先就是从 Drp1 介导的线粒体分裂开始的[10]，线粒体是一种真核细胞必需的细胞器，除了提供能量外，还在各种细胞过程中发挥着重要作用[8]。线粒体是缺血缺氧损伤的主要靶点，而随着缺血持续时间的延长，线粒体损伤会加重，这反过来又会损害细胞能量代谢[11-12]。Drp1介导的线粒体凋亡机制是Drp1可以促进Bax向线粒体聚集、细胞色素C释放和Caspase激活，Drp1也可以直接与BAX相互作用，诱导Bax向线粒体移位导致凋亡[13]；Drp1表达上调后抑制谷胱甘肽清除自由基的能力导致ROS水平的上调诱导凋亡[14]；也有可能上述反应的综合作用结果。另有研究表明谷氨酸可通过Drp1/Bax/Cyto-C/ Caspase-3信号级联反应诱导细胞凋亡，增加线粒体膜通透性、细胞色素C释放和Caspase-3的激活，并且发现Bax和Drp1在线粒体中共定位并诱导细胞线粒体凋亡[15]。

最新研究显示缺血可通过Drp1介导的线粒体裂变引起血管功能障碍[16]，且Drp1在创伤性损伤中诱导缺血细胞功能障碍[17]。体外脑缺血再灌注损伤过程中神经元细胞的线粒体分裂增加，反之抑制线粒体分裂、抑制线粒体的片段化，可以减轻神经元的凋亡[18]。本实验中加入外源性VEGF后缺氧复氧神经元细胞中Drp1蛋白减少，说明外源性VEGF对神经元细胞的保护作用可能通过抑制Drp1介导的线粒体凋亡途径来抑制神经元细胞凋亡，该机制与右美托咪定对大鼠神经元的缺氧复氧保护作用机制类似[19]，而且有科学家证实在大鼠活体脑缺血模型中射适量的VEGF可改善大鼠脑缺血模型中梗死面积，抑制神经细胞凋亡[20]。当然缺血性脑损伤是多种生物功能和通路引起的[21]，VEGF也可能是通过多种通路联合抑制神经元细胞的凋亡。

总之，缺氧复氧神经元细胞在加入外源性VEGF后细胞凋亡减少，可能机制是抑制Drp1介导的线粒体凋亡，为颅脑缺血再灌注损伤治疗提供又一理论支持。