王幼珊 王晓燕 张淑彬 石瑶瑶 盖京苹 殷晓芳 邢礼军

( 北京市农林科学院，北京，100097) ( 台州学院) ( 北京市农林科学院) ( 中国农业大学) ( 北京市农林科学院)

丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizal，AM)真菌属球囊菌门(Glomeromycota)，是自然界与植物共生关系最古老也最为密切的微生物之一，超过80%的陆生植物可与AM真菌形成互利共生关系，为宿主植物提供水分和矿质养分[1-2]。随着形态学鉴定与分子生物学技术的结合，AM真菌分类系统也日趋完善。Schuler(http://schuessler.userweb.mwn.de/amphylo/)和Redecker et al.[3]公布的分类系统中已发现AM真菌近300种。中国已发现并报道的有147种，其中包括13个新种[4]。

日喀则位于我国西藏自治区西南部，喜马拉雅山脉中段以北，冈底斯山脉和念青唐古拉山之间，地形复杂多变，海拔差异较大，平均海拔4 000 m以上[5]。林芝位于西藏自治区东南部，气候独特，海拔落差大，平均海拔3 000 m左右。西藏地区物种资源丰富，被国际环保组织划入全球34个物种最丰富且受到威胁最大的生物多样性热点地区。该地区蕴藏着丰富的AM真菌资源。研究表明，AM真菌对西藏地区植被和农作物(例如青稞)的生长有显著的促进作用[6-8]。

1 材料与方法

1.1 样品采集与孢子扩繁

以西藏日喀则地区白朗县和江孜县为调查区域，采集马蔺(IrislacteaPall. var.chinensis(Fisch.) Koidz.)、血满草(SambucusadnataWall. ex DC.)和小麦(TriticumaestivumL.)根际土壤。采样时，去除土壤表面枯枝落叶，采集地表以下25 cm范围内的土壤1 kg放入自封袋带回实验室，以高粱为宿主进行诱导培养、单孢扩繁[11]获得纯种AM真菌菌剂。

1.2 形态学观察

取培养的纯种AM真菌菌剂10 g，通过湿筛倾析法筛取孢子[11]，从每个菌种筛取的孢子中挑取50～100个，在体视显微镜下以水浮载液观察孢子形态。然后分别将一半数量的孢子放入PVLG和PVLG+Melzer’s试剂中制成装片，在光学生物显微镜下进行孢子显微结构观察，记录孢子颜色、大小、壁层结构和连孢菌丝等形态特征。

1.3 DNA提取、PCR扩增、测序及系统发育分析

从每种AM真菌菌剂分离的孢子中取10个，放入装有体积分数2%氯胺-T的1.5 mL离心管中消毒1 min，然后用灭菌的蒸馏水清洗5次后将孢子转移到含有14 μL TE buffer的离心管中，用无菌移液器吸头将孢子捣碎，离心后取上清液即获得孢子总DNA。先后分别用引物ITS1(5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’)与NDL22(5’TGGTCCGTGTTTCAAGACG3’)和LR1(5’GCATATCAATAAGCGGAGGA3’)与FLR2(5’GTCGTTTAAAGCCATTACGTC3’)进行巢式PCR对28S rRNA部分区域进行扩增[12]。

第1次PCR扩增采用真菌通用引物ITS1/NDL22，包括5.8S rDNA和部分28S rDNA，片段长度约1 300 bp。反应体系为20 μL，包含10×PCR buffer(包含Mg2+)2.0 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)1.6 μL，Takara Taq酶(5 U·L-1)0.1 μL，DNA模板1.0 μL，引物ITS1(10 mmol·L-1)和NDL22(10 mmol·L-1)均为0.5 μL，ddH2O 14.3 μL。反应条件：94 ℃,4 min;(94 ℃,30 s;58 ℃,1 min;72 ℃,1 min)30循环;72 ℃,10 min。第1次PCR产物稀释10倍用于第2次PCR的模板。第2次PCR采用引物LR1/FLR2进行扩增。反应体系与反应条件与第1次PCR相同。

第2次PCR产物经1.5%琼脂糖胶检测后送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。所得序列经SeqMan校对和拼接，然后提交至NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取登录号。在NCBI数据库通过BLAST获得相似度较高的序列用MUSCLE[13]软件对本研究测序所得序列与已知序列对齐，用MEGA X[14]通过ML分析寻找最优模型后构建最大似然进化树。用Bootstrap 1 000次来评估分值的可靠性。Dominikia属和Rhizophagus属目前分别有12个和5个物种的序列可与本研究所测区域比对，用于构建进化树。

2 结果与分析

2.1 印度多氏囊霉Dominikia indica Baszk., Chwat & Kovács(2015)

≡GlomusindicumBaszk., Wubet, Harikumar Botany 88(2):132(2010)

孢子形成于土壤中，着生在疏松的根外菌丝上(图1A)，孢子透明至亮黄色，球形至近球形，直径35 μm。孢子壁两层(L1和L2，图1A，图1C)，黏在一起，外层(L1)黏质，透明，厚1.0 μm，在Melzer’s试剂中染成粉红色到红色(图1B)，成熟孢子中易脱落；内层(L2)单一壁或层状壁，亮黄色，厚1.5～3.0 μm。连孢菌丝透明，圆柱形到小漏斗形，有时弯曲，连点宽3.0～6.1 μm，偶尔有隔，由孢子的两层壁延伸形成(图1C)。

样本信息：标本编号BGC XZ10，从西藏日喀则市江孜县年堆乡卓萨村(28°52′14.25″N,89°41′22.61″E，海拔4 101 m)马蔺(IrislacteaPall. var.chinensis(Fisch.) Koidz.)根围土中分离获得。

2.2 异形根孢囊霉Rhizophagus irregularis C. Walker & Schuessler(2010)

≡GlomusirregulareBaszk., Wubet, Renker & Buscot, Mycotaxon 106:252.2008

孢子果未见。孢子聚集分布在根内(图2A)或土壤中，有时单生于土壤中；透明、乳白、浅黄至黄棕色。球形，近球形，卵球形，长圆形或不规则，直径70～145 μm(连孢菌丝方向)(图2B)。孢子壁3层(L1，L2和L3)(图2C，2D)，L1为最外层，半永久壁，透明，0.5～1.5 μm厚，成熟时脱落，不与Melzer’s试剂发生染色反应；L2半永久壁，透明，当幼孢子完整时，黏附于L1上，1.0～4.5 μm厚，随着孢子成熟和变老，该层与L3分开，与L1同时降解，成熟的孢子中，L1和L2消失或残余；最内层为L3，永久层状壁，淡黄色到黄棕色，1.8～5.0 μm厚，可见分开的亚层，在Melzer’s试剂中染成粉色或红色(图2D)。连孢菌丝透明至浅黄，圆柱形或小漏斗形，有时溢缩或弯曲，连点宽8.0～13 μm，敞开，偶尔有隔(图2C)，连孢菌丝的3层壁(HL1，HL2和HL3)由孢子的3层壁延伸形成(图2C，2D)。

样本信息：样本BGC XZ11B从西藏日喀则市白朗县巴扎乡扎西岗村(29°9′57.96″N,89°12′19.94″E，海拔3 880 m)小麦(TriticumaestivumL.)根围土中分离。样本BGC XZ04B从西藏林芝市米林县索松村(29°36′53.57″N,94°55′19.34″E，海拔3 190 m)血满草(SambucusadnataWall. ex DC)根围土中分离。

A为在PVLG中随机分布的孢子和孢子壁层；B为孢子与连孢菌丝在Melzer’s试剂中的反应；C为孢子壁层及连孢菌丝。

A为体视镜下水浮载液中的孢子；B为PVLG中随机分散的孢子；C为孢子壁层(L1,L2和L3)及连点处的隔S(Septum)；D为Melzer’s试剂中的孢子壁层结构(L1,L2和L3)和连孢菌丝壁层结构(HL1,HL2和HL3)。

2.3 系统发育分析

将测序所得序列提交至NCBI数据库，获得登录号。样本BGC XZ10、BGC XZ11B、BGC XZ04B-216、BGC XZ04B-217和BGC XZ04B-218登录号分别为MT936436、MT936437、MW007887、MW007888、MW007889。系统发育分析表明，样本BGC XZ10与Dominikiaindica、D.bernensis和D.minuta聚为一支，具有较高的支持率(99%)(图3)，结合形态学特征，鉴定为D.indica。

系统进化分析表明样本BGC XZ11B、BGC XZ04B-216、BGC XZ04B-217和BGC XZ04B-218与Rhizophagusirregularis聚为一支，支持率为98%(图4)，结合形态学特征鉴定为R.irregularis。

3 结论与讨论

印度多氏囊霉Dominikiaindica分离于印度南部喀拉拉邦滨海沙地白苞猩猩草(Euphorbiaheterophylla)和非洲东北部的厄立特里亚国莴苣(Lactucasativa)的根际土中。首次发现被命名为Glomusindicum[15]。之后在Dominikia属的介绍中更名为D.indica[16]。以大叶车前(Plantagolanceolata)为宿主，D.indica单孢培养物可形成泡囊—丛枝结构[15]。此外，该种还分布于美国、爱沙尼亚和澳大利亚，分布范围较广泛，但是在中国的分布是首次报道。

D.indica形态特征与微丛球囊霉Glomusmicroaggregatum、伯尔尼多氏囊霉Dominikiabernensis和无色多氏囊霉Dominikiaachra相似。但是，G.microaggregatum的孢子壁不会被Melzer’s试剂染色；D.bernensis的孢子形成密集的孢子果，并且连孢菌丝有隔；D.achra孢子壁有3层(L1,L2和L3)，其中L1和L3能被Melzer’s染色，并且L3受到压力会与L2分离开。系统发育关系中，D.indica与D.minuta聚为一支，但是两者形态差异较大。D.indica孢子透明至亮黄色，簇状着生，外层孢子壁会被染成粉红色至红色，而D.minuta孢子透明，单生或聚集生长在根上，孢子壁较薄且不会被染色[17]。

异形根孢囊霉Rhizophagusirregularis首次于1993年在波兰西北部海岸沙丘上的蜂斗菜(Petasitesspurius)根围土中发现，2008年由Baszkowski等人首次命名为Glomusirregulare[18]，该种形态上与根内根孢囊霉Rhizophagusintraradices非常相似。但是R.irregularis孢子壁的L1不与Melzer’s试剂发生染色反应，L3在Melzer’s试剂中被染成粉色或红色；而R.intraradices孢子壁L1在Melzer’s试剂中染成粉色或红色，L3在Melzer’s试剂中无反应。

序列的登录号位于圆括号内；系统发育树分支点处的数字表示置信度(>50%)。

序列的登录号位于圆括号内；系统发育树分支点处的数字表示置信度(>50%)。

R.intraradices在旧分类系统为Glomusintraradices[19]。由于这两个种形态相似，有一段时间被混淆，后因R.irregularis在2013年首次被全基因组测序[20]，国内一些研究者在用新分类系统发表文章时直接将试验所用菌种G.intraradices写成R.irregularis，这是完全错误的。R.intraradices和R.irregularis已被Schuler和Walker于2010年证明为是两个不同的种[21]。