魏卓昕，石贤文，张文双，徐凌云

(武汉轻工大学生命科学与技术学院，湖北 武汉 430023)

黄芩苷微乳凝胶是我院研发的皮肤外用制剂，活性成分为黄芩苷。黄芩苷是从黄芩的干燥根中提取的一种黄酮类化合物，有抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种药理作用[1]。根据《中华人民共和国药典》2020版(ChP2020)中微生物限度检测方法有关规定，皮肤外用半固体制剂不得检测出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，需氧菌数目应小于100 cfu/mL[2-3]。由于黄芩苷具有抑菌作用，常规法不能真实反映该药物制剂的微生物污染情况。本研究采用中和剂法及薄膜过滤法进行渐进式研究，建立黄芩苷微乳凝胶微生物限度检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品和试剂

黄芩苷微乳凝胶(自制[4]，规格为每支10 g，黄芩苷含量为50 mg/10 g，批号：21040705)，吐温80(天津市大茂化学试剂厂，批号：20210301)，大豆卵磷脂(河南四维生物科技有限公司，批号：20210201)，0.9%无菌氯化钠溶液(山东科伦药业有限公司，批号：B21011301B)，胰酪大豆胨液体培养基(杭州百思生物技术有限公司，批号：20210326)，0.45 μm无菌滤膜(天津津腾实验设备有限公司，批号：20210329)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(杭州百思生物技术有限公司，批号：20201012)，琼脂粉(北京索莱宝科技有限公司，批号923H022)，溴化烷基十六烷三甲胺培养基(杭州百思生物技术有限公司，批号：20210402)。

1.1.2 菌株

金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]均由中国食品药品检定研究院提供。

1.1.3 仪器

电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司，型号：DHG-90170A)、立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂，型号：YXQ-50SⅡ)、生化培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司，型号：SPX-300BSH-Ⅱ)、超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司，型号：SW-CJ-1FD)、微波炉(格兰仕微波炉电器有限公司，型号：P70D17TL-D5)、振荡培养箱(上海知楚仪器有限公司，型号：ZQLY-300F)和紫外分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司，型号：WFJ7200)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备

参照ChP2020(四部)1105项下规定，采用传代次数不超过5代的菌株。取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌分别接种至胰酪大豆胨液体培养基中，于37 ℃下培养24 h，作为新鲜培养物；取各试验菌新鲜培养物1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液进行梯度稀释，直至得到含菌量为100 cfu/mL及1 000 cfu/mL菌悬液，备用[5-6]。

1.2.2 微生物计数法适应性试验

1.2.2.1 中和剂法

含中和剂的稀释液配制：称取0.75 g大豆卵磷脂与10.00 g吐温80，加0.9%无菌氯化钠溶液至250 mL，得到含0.3%大豆卵磷脂和4.0%吐温80的稀释液。取黄芩苷微乳凝胶10 g加中和剂稀释液至100 mL，得到1∶10的供试液a。以供试液a为母液，稀释得到1∶20的供试液b以及1∶50的供试液c。试验组：取供试液a，b，c各9 mL和含菌量为1 000 cfu/mL的各试验菌液1 mL，混匀后，取1 mL注入平皿中，使得各试验组最终含菌量为100 cfu。对照组：取中和剂稀释液1 mL，注入平皿中。菌液组：取0.9%无菌氯化钠溶液9 mL和含菌量为1 000 cfu/mL的各试验菌液1 mL，混匀后取1 mL注入平皿中[7]，最终含菌量为100 cfu。各组平皿分别加入胰酪大豆胨琼脂培养基约20 mL摇匀，凝固后，规定的条件下培养24 h，计数。每种试验菌平行制备2个平皿，计算回收比值，回收比值=(试验组菌落数-对照组菌落数)/菌液组菌落数，回收比值为0.5～2.0符合ChP2020微生物限度检查方法适应性检查的规定。

1.2.2.2 薄膜过滤法

取黄芩苷微乳凝胶10 g，加入0.9%无菌氯化钠溶液至100 mL，顺同一方向充分振摇，制成1∶10的供试液A。以供试液A为母液，依次用0.9%无菌氯化钠稀释制备成1∶20的供试液B及1∶50的供试液C。试验组：取供试液B和供试液C各1 mL，加入100 mL 0.9%无菌氯化钠溶液，用0.45 μm薄膜过滤，用0.9%无菌氯化钠冲洗2次，每次100 mL[8]。在最后一次冲洗液中分别加入含菌量不大于100 cfu/mL的“1.2.1”下各菌液1 mL。对照组：取制备好的供试液B和供试液C各1 mL，不加试验菌，其余操作同试验组。菌液组：除不加供试液外，其余操作同试验组。过滤完毕后，将制备好的滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，按规定条件倒置培养，计数。每个试验菌平行制备2个平皿，按1.2.2.1项下方法计算回收比值。

1.2.3 控制菌适用性试验

控制菌检查法系在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。黄芩苷微乳凝胶属于非无菌局部皮肤给药制剂，根据ChP2020(四部)1106和1107项下规定，不得检测出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。参照“1.2.2.2”实验结果，取1∶20供试液B以薄膜过滤法进行控制菌实验。试验组：取供试液A(相当于1 g或1 mL供试品的供试液)，加入100 mL 0.9%无菌氯化钠溶液，薄膜过滤，用0.9%无菌氯化钠冲洗2次，每次100 mL。阳性对照组：用0.9%无菌氯化钠冲洗无菌滤膜2次，每次100 mL，在最后一次冲洗液中分别加入含菌量不大于100 cfu/mL的金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌菌液1 mL。阴性对照组：取0.9%无菌氯化钠溶液1 mL，加入100 mL 0.9%无菌氯化钠溶液，薄膜过滤，用0.9%无菌氯化钠冲洗2次，每次100 mL。

上述各组制得的滤膜置入装有100 mL胰酪大豆胨液体培养基的锥形瓶中，37 ℃培养24 h，分别取各组培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板或溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，37 ℃培养24 h，肉眼观察各平皿是否长菌。若试验组和阴性对照组不长菌，阳性对照组长菌，则记为未检出。若试验组长菌，培养结束后，对铜绿假单胞菌进行氧化酶试验：将洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取试验组平板上生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸N，N-二甲基对苯二胺试液，在30 s内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性[2]。

2 结 果

2.1 中和法适用性试验结果

中和剂法的各试验菌回收比值结果见表1，黄芩苷微乳凝胶10倍稀释、20倍稀释及50倍稀释试验组的三种细菌的回收比值均低于0.5，表明黄芩苷微乳凝胶的抑菌效果未完全清除。各试验菌菌液组细菌生长良好，如图1所示。

表1 中和剂法黄芩苷微乳凝胶各稀释组三种细菌的回收比值

(a) (b) (c)

2.2 薄膜过滤法适用性试验结果

黄芩苷微乳凝胶在20倍稀释时，各试验菌回收比值分别为0.73，1.00，0.96(见表2)，均符合ChP2020的要求，后续选用黄芩苷微乳凝胶20倍稀释和薄膜过滤法进行控制菌试验。黄芩苷微乳凝胶20倍稀释时薄膜过滤法的三种细菌培养见图2，各试验组均有细菌生长，且回收比值在正常范围。

表2 薄膜过滤法黄芩苷微乳凝胶各稀释组三种细菌的回收比值

(a) (b) (c)

2.3 控制菌适用性试验

黄芩苷微乳凝胶微生物限度检查结果见表3。在各菌种控制菌检测中，各试验组均未检测出试验菌。

表3 控制菌检查方法适用性试验结果

3 讨 论

黄芩苷抗菌效果显著，能通过影响DNA的合成、酶的活性以及线粒体膜电位，抑制白色念珠菌的生长，并通过影响细胞信号通路、酶活性及干预生物膜的形成与发展对金黄色葡萄球菌产生抑菌作用。黄芩苷在干预铜绿假单胞菌生物膜生成、减少多糖蛋白复合物产量及抑制mRNA的表达效果方面也有明显作用[9-12]。鉴于黄芩苷的广谱抑菌作用，黄芩苷微乳凝胶中潜在的微生物可能处于失活状态。局部给药时，药物在患者体内释放后，这些菌株可能会恢复活性，从而对机体健康造成威胁。黄芩苷微乳凝胶作为一种非无菌制剂，诸多生产环节和外部因素均可能造成污染，因此，进行微生物限度检测是必要的[13]。由于不具备白色念珠菌和黑霉菌微生物限度检测的实验环境和设备，本文未对这两种试验菌进行检测。

中和剂法可去除药物本身的抑菌性[14]。ChP2020(四部)1105项下对中和剂的选用标准并不明晰，所以选用合适的中和剂是采用这种方法时首先要解决的问题[15]。牟建平等[16]分别采用硫酸锰、硫酸镁、氯化钡、氯化钙和氯化镁作为中和剂破坏林可霉素利多卡因凝胶的胶束结构，并联用薄膜过滤法比较这五种中和剂对微生物限度检测结果的影响。结果发现，以硫酸锰和硫酸镁作为中和剂时，供试液中均产生黄色油状不明物质，无法通过薄膜。氯化钡本身为剧毒物质，氯化钙容易与凝胶中的碳酸根离子反应生成沉淀，不易过滤，故以上两种中和剂亦不是最优选择。而氯化镁作为中和剂时，能与辅料形成容易清除的络合物，各菌株的回收率均符合要求。由此可见，中和剂的正确选用直接关系到实验的最终结果。吐温80和大豆卵磷脂合用可降低酚、醛、季铵类化合物的药用活性[17]。张秀花等[18]以3%吐温80和0.3%卵磷脂作为中和剂对十种中药制剂进行微生物限度检测，各菌株回收比值均在0.94～1.03。黄芩苷为多羟基黄酮类单体化合物，本实验选用含4.0%吐温80和0.3%大豆卵磷脂的0.9%无菌氯化钠溶液做稀释剂，以期中和黄芩苷的抑菌效果。但实验结果显示，各试验菌的回收比值均低于0.5，即这两种中和剂在该比例下无法去除黄芩苷微乳凝胶的抑菌性。此外，黄芩苷微乳凝胶中本就以吐温80作为表面活性剂，猜测吐温80与卵磷脂的比例可能会影响实验结果。

薄膜过滤法常用于去除药物抑菌性成分[19]。本实验采用0.45 μm的微孔滤膜截留微生物，再在适宜条件下培养，使其增殖并形成单菌落，通过肉眼计数并计算回收比值，从而定性或定量检测微生物。此外，供试液过滤后，用稀释液反复冲洗滤膜，可清除抑菌成分黄芩苷和焦亚硫酸钠[20]。实验结果表明，薄膜过滤法可有效去除黄芩苷微乳凝胶对3种试验菌的抑菌作用，其中以20倍稀释时效果最好，经计算三种试验菌回收比值分别为0.73，1.00和0.96，符合ChP2020的要求。当稀释倍数为50倍时，三种菌株的回收比值均降低。尽管薄膜过滤法适用于黄芩苷微乳凝胶微生物限度测定，但部分凝胶制剂因黏度过大经稀释后也无法通过薄膜，故此方法也并非适用于所有药物。有研究采用中和剂法联合薄膜过滤法进行实验[16，18]，虽然ChP2020并未明确两法合用的检测规定，但这也可为微生物限度测定提供新思路。

综上所述，本实验建立的薄膜过滤法能解决黄芩苷微乳凝胶中抗菌成分干扰的问题，适用于该制剂的微生物限度检测。