范 硕, 张小娜, 侯艳红, 霍瑞朋, 王子铭, 殷凯玥, 张雪雪, 赵莹莹, 王巨媛

(1.聊城大学农学与农业工程学院, 山东 聊城 252000;2.聊城大学地理与环境学院, 山东 聊城 252000)

抗生素是微生物次级代谢产生的具有杀灭病原微生物作用的化学物质，在感染治疗与预防中有显著效果[1]。自20世纪弗莱明发现青霉素以来，抗生素对人类生命健康和社会发展做出卓越的贡献。人们过度依赖抗生素防治病虫害，且缺乏对抗生素合理使用的认识，导致抗生素使用量大大增加[2]。我国每年使用抗生素约16.2万t，约占世界用量的一半，其中52%为兽用[3]，进入动物体内的抗生素约有一半以上通过排泄物方式，以原药或初级代谢产物的形式进入到环境中，大量抗生素残留污染环境影响作物正常生长[4-6]。有报道上海黄浦江上游通过施用粪肥进入到土壤中的磺胺类抗生素浓度达到5.85～33.37 mg/kg[2]。在自然界，抗生素可通过多种途径(如水、土、动植物等)进行传递，直接或间接地对环境造成不利影响[7-9]，且残留在环境中的抗生素经过循环累积进入食物链，对食品安全埋下重大隐患，包括家禽[10]、鱼类[11]、牛奶[12]、虾类[13]食品中均已检测到残留。

油菜栽培遍及全国，种植面积占中国油料作物的40%，菜籽油占我国国产食用植物油总产的60%左右[12]。油菜的花粉功能强大，含多种营养元素，具有抑制肿瘤、调节血脂等多种作用。同时油菜也具有很高的观赏价值，近年来油菜观光旅行已成为多地区新开发的特色旅游项目。

自然界中人类处于食物链顶端，因此，各方面的食品安全问题一直都是关注的焦点。李亚宁等[15]研究磺胺抗生素对油菜幼苗氧化酶的影响，表明ST及SMZ对油菜叶绿素含量及SOD、POD活性均被显著诱导。但抗生素对油菜花种子的影响未见报道，本文以油菜花种子为试材，开展SM 2、TC、NX 三种抗生素对油菜花种子及幼苗生长影响的研究，分析不同抗生素对油菜花的生态毒性效应，为抗生素环境风险评价及规范使用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试油菜种子购于江苏省连云港市种子站；SM 2、TC、NX三种抗生素纯度为99%，购于上海麦克林公司。

1.2 试验仪器

根系扫描系统(Win RH 220 STO 1600 Systems)——加拿大

生物荧光倒置显微镜(BX 51)——日本奥林巴斯株式会社

1.3 试验方法

试验共设6个处理，3种抗生素浓度均为ck(无抗生素添加)、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L。各处理重复3次。采用培养皿发芽法，挑选饱满油菜种子，以3%的过氧化氢溶液浸泡消毒20 min，用去离子水反复冲洗数次，以50粒为一组置于恒温箱内进行催芽，催芽温度(25±1)℃，记录发芽率、发芽势。

发芽率(%)=(发芽种子粒数/供试种子粒数)×100%

发芽势(%)=(发芽天数为3 d时发芽的粒数/供试种子粒数)×100%

发芽结束后，每处理选出5个具有代表性的油菜种子，使用根系扫描系统测定根总长、根表面积、根分叉数、根体积及油菜根系形态扫描图。

根长抑制率(%)=[(对照根长-处理根长)/对照根长]×100%

油菜根损伤鉴定方法：分别取各处理的油菜根部组织置于20 μmol/L 二乙酸荧光素(FDA)中，37 ℃条件下浸染20 min后，用0.05 mmol/L PBS(pH=7.0)清洗3～5次后在生物荧光倒置显微镜下拍照[10]。

1.4 数据处理与分析

方差分析采用SPSS 19软件进行，运用ANOVA方法分析处理间差异显著性，采用Origin 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对油菜种子发芽率和发芽势的影响

种子发芽率反映种子生命力和生活力的强弱[16-17]。植物种子的萌发是植物生长发育过程中的关键阶段，油菜种子萌发情况会直接影响油菜植株的生长、产量及观赏价值。由表1所示，SM 2表现为低浓度促进油菜种子发芽，12.5～50 mg/L时种子发芽率与对照相比达到显著水平，在50 mg/L时发芽率达到最高，浓度在100 mg/L、200 mg/L时发芽率与ck差异不显著。发芽势在25 mg/L时最低，在200 mg/L时最高。TC浓度为12.5 mg/L时发芽率达到最高；25～200 mg/L时抑制油菜种子发芽，200 mg/L时抑制作用最强，发芽率最低，除12.5 mg/L处理外其他处理与ck相比均达到显著水平，发芽势在12.5 mg/L时最高，200 mg/L时最低。NX各处理对油菜种子发芽均表现抑制作用，除12.5 mg/L处理外，其他处理与ck相比均达显著水平，发芽势在200 mg/L时最低。

2.2 不同处理对油菜种子根长、根长抑制率的影响

由图1～图3所示抗生素对油菜种子根长的影响均表现为抑制，根长抑制率与抗生素浓度之间存在剂量效应关系。TC的浓度变化对油菜种子根伸长的抑制作用最明显，浓度为12.5 mg/L的TC处理对根长生长已表现出较强的抑制作用，浓度越高抑制作用越强；SM 2的浓度变化对种子根伸长的抑制作用弱于TC处理；油菜种子根长对NX的浓度变化最不敏感，在最高浓度(200 mg/L)根长抑制作用最强。

2.3 不同处理对油菜根表面积、分叉数及根体积的影响

抗生素对油菜根表面积、分叉数、根体积及幼苗形态的影响见图4～图7。SM 2浓度为25 mg/L时根表面积、根体积达到最高值；50 mg/L时分叉数最多。随着SM 2浓度的增大根系生长受到抑制，根体积减小，侧根减少。TC浓度越大对根的抑制作用越强，各浓度根表面积、根分叉数、根体积与ck相比整体均呈下降趋势。NX对根生长整体表现为抑制作用，根分叉数在50 mg/L时最多，在25 mg/L根体积达最大值，但与ck相比差异不显著，随浓度增加根体积变小抑制作用变强。

表1 抗生素对油菜种子发芽的影响Table 1 Effect of antibiotics on seed germination of rapeseed

图1 SM 2对油菜根长、根长抑制率的影响Fig.1 Effect of SM 2 on root length and inhibition rate of rapeseed

图2 TC对油菜根长、根长抑制率的影响Fig.2 Effect of TC on root length and inhibition rate of rapeseed

图3 NX对油菜根长、根长抑制率的影响Fig.3 Effect of NX on root length and inhibition rate of rapeseed

图4 不同抗生素对根表面的影响Fig.4 Effects of antibiotics on root surface area

抗生素与油菜种子发芽及根生长指标相关性见表2，发芽率、根长、根表面积、根体积与抗生素浓度之间呈负相关，TC不同处理与发芽势相关性最大(R2=0.784 1)；NX处理与根长、根表面积、根体积相关性均较大(R2依次为0.817 5、0.836 4、0.828 5)。仅NX处理的根分叉数与抗生素浓度之间及SM 2与发芽势间呈正相关，且R2值较低。

2.4 不同处理对油菜根损伤的影响

利用荧光双醋酸酯(FDA)燃料染色植物细胞，当FDA进入活细胞后能生产绿色荧光物质，在荧光显微镜下观察荧光强度就能够判定油菜根系细胞活力的强弱。当植物受到外界胁迫时，FDA染色可以作为评价外源物质诱导植物细胞死亡的重要指标之一[18]。

图7 不同抗生素对油菜幼苗的影响Fig.7 The effect of antibiotics on Brassica campestris seedings

表2 抗生素与油菜种子发芽及根生长的相关性Table 2 Correlation between antibiotics and seed germination and root length of rapeseed

图5 不同抗生素对根分叉数的影响 Fig.5 Effects of antibiotics on root bifurcation number

图6 不同抗生素对根体积的影响Fig.6 Effects of antibiotics on root volume

SM 2对油菜幼苗根系损伤情况见图8(A)，与ck相比，12.5 mg/L处理细胞着色良好亮度高，细胞活力强，故浓度为12.5 mg/L处理对油菜根系细胞活力影响较小，随着SM 2浓度的增大，油菜根系荧光区域逐渐减少，亮度也随之减弱，表明油菜根系细胞活力逐渐减弱。TC对油菜幼苗根系损伤的影响见图8(B)，与ck相比，各处理下的油菜根系细胞均有一定程度的受损，在本试验中随着TC浓度增大油菜根系荧光亮度逐渐减弱，油菜根系细胞活力呈减弱趋势。NX对油菜幼苗根系损伤的影响见图8(C)，与ck相比，12.5 mg/L、25 mg/L处理下的油菜根系受到的损伤不明显，随浓度增大到50 mg/L后即表现出较为明显的损伤，随着NX浓度增大，油菜根系荧光亮度相应减弱，细胞活力呈减弱趋势。

3 讨 论

种子萌发期和幼苗期是植物对外界环境因子的敏感期，直接影响植物的生长发育。魏瑞成等[16]研究不同浓度梯度的金霉素对油菜种子发芽的影响，结果表明，不同浓度处理对其发芽率及发芽势无显著差异，但株高和根长受到明显抑制，根长对金霉素生态毒性更为敏感[19]。张树清等[20]研究表明，随处理金霉素浓度的提高，大白菜的主根长、单株鲜重均呈先增加后降低的趋势。邓世杰等[21]研究金霉素对黄瓜、西葫、冬瓜种子萌发，表明金霉素对黄瓜种子的发芽表现为低浓度促进，高浓度抑制。均与本研究结论大方向一致。

图8 不同SM 2、TC、NX浓度对油菜根损伤的影响Fig.8 Effects of different SM 2、TC、NX concentrations on root injury in rape

植物根系是吸收环境中水分和养分的主要器官，地下部根系的形态和生长状况直接影响整株植物的生长发育[22-23]。廖德润等[24]的研究结果反映出，低浓度抗生素对植株生长具有诱导刺激效应，而高浓度条件下则表现出抑制毒害效应，植株中可溶性蛋白含量以及抗氧化酶活性均受到抑制。本研究结果表明，3种抗生素对油菜根生长有不同影响，低浓度的SM 2对油菜种子发芽及根系发育均有促进作用，随抗生素浓度的提高对种子萌发的抑制作用不断增强，TC、NX对油菜根系生长均表现为抑制作用，NX浓度高于25 mg/L时对油菜发芽抑制作用与ck相比达到显著水平，NX处理下，油菜根系的根长、根表面积随抗生素浓度的增大逐渐降低，侧根数减少。FDA染色法能够反映细胞活力。在高浓度抗生素胁迫下，油菜根系活力明显减弱，说明抗生素一旦超过浓度限制范围就会抑制油菜根系活力，影响根系对养分的吸收，根系固持能力也会不断减弱。表明当抗生素浓度达到一定阈值，抗生素的毒害作用会不断表现出来。本研究中，3种抗生素对油菜抑制作用由强到弱排列依次为TC、SM 2、NX。抗生素对油菜的光合、荧光等生理指标的影响还有待进一步探究。

综上所述，要注意科学合理的使用抗生素，在园林、园艺、大田作物、畜牧业等生产加工中应严控抗生素的施用量，并采用合理方法有效去除环境中残留的抗生素及抗生素代谢物，促进生态环境健康发展。