张孟琴 ，徐 路，张俊波，欧根友，向 嫒

（1.铜仁学院，材料与化学工程学院，贵州铜仁 554300；2.铜仁学院，贵州省梵净山地区生物多样性保护与利用重点实验室，贵州铜仁 554300；3.铜仁市农业科学院，贵州铜仁 554300）

三叶木通（Akebia trifoliata）也称“八月瓜”、“野香蕉”等，果实在中秋节前后成熟，且形似香蕉，属多年生落叶木质藤本植物[1−2]，是典型的“食药油赏”同源植物。果实甘甜味糯，富含人体生长发育所需的多种营养及活性成分[3−4]，有“天然保健圣果”之美誉，在我国河南、陕西、贵州、甘肃及长江流域等多省份均有分布[5]。国内外学者研究发现，三叶木通根、藤及果皮均富含齐墩果酸、常春藤皂苷、黄酮、多酚、萜类等活性成分[6−10]，具有抗氧化、降血糖、通经活血、保肝防癌、抑菌美白等多种功效[10−13]。罗宗洪等[10]研究了云南野生三叶木通，发现其果皮和种籽的提取物能较好地抑制α-葡萄糖酶活性。张可兰等[12]的研究表明，三叶木通藤茎总黄酮对小鼠的急性肝损伤组织有明显的改善和保护作用；Lu等[13−14]均发现三叶木通种子提取物能显著抑制肝癌细胞的侵袭、迁移及增值；钟彩虹等[15]的研究显示，三叶木通果实提取物对赖氨酸酶的抑制作用与熊果苷相当，可有效抑制黑素细胞的增殖；魏晶[16]从三叶木通藤茎提取的多糖能清除多种自由基，而且对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有显著的抑制作用。仲伟敏等[17]和白成科[18]对三叶木通种子中的脂肪酸及氨基酸和矿质元素进行了测定，其结果显示，在所测的脂肪酸中不饱和脂肪酸含量占74.51%，测定的氨基酸中人体必需氨基酸占55.19%，且矿质元素（K、Mg、Fe、Cu）含量均高于花生和玉米等作物。此外，以三叶木通种籽为原料制备生物柴油的研究也取得了初步成效[19]。

近年来，野生三叶木通的人工栽培技术已经实现突破并趋于成熟[20]，在我国陕西、四川、贵州、湖北、河南等省份己开始较大规模的种植和产业化初步开发。目前，以三叶木通为原料开发的果茶、果酒、饮料、食用油脂等产品正逐步进入市场，因其绿色、健康、保健等良好功效，开始受到越来越多人的青睐。种植业的快速发展必然带动三叶木通深加工产业的不断优化，其开发潜力不可估量。相比栽培技术的不断创新和种植面积的不断扩大，三叶木通的深加工水平才刚刚起步，产品远不能满足市场需要，尤其果实的可食率极低，非可食果皮占果实总重量的60%～70%。本研究测定了三叶木通果皮中蛋白质、脂肪、矿质元素、粗纤维、VC等主要营养成分及总黄酮、总酚、总皂苷等功能活性成分的含量，并研究了果皮提取物的抗氧化活性，这些研究可为三叶木通资源的综合利用提供一定的理论依据，同时，对提高三叶木通的经济价值、助力山区农民脱贫攻坚具有重要的经济和社会意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野生三叶木通果实 采自贵州铜仁谢桥镇，经同行专家鉴定为三叶木通Akebia trifoliate的果实；芦丁、没食子酸、齐墩果酸、ABTS（2,2'-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐）、DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）均为标准品 Sigma公司；各单元素标准溶液（浓度均为1000 μg/mL） TMRM坛墨质检标准物质中心；其他试剂 均为分析纯。

UV1800紫外可见分光光度计 日本Shimadzu公司；ETHOS-1型微波消解仪 意大利Miletstone公司；Prodigy ICP原子发射光谱仪 美国Leeman公司；Kjeltec 8200 全自动凯氏定氮仪 德国Fuchs公司；KSL-1400X箱式马弗炉 合肥科晶材料技术有限公司；FA2004电子分析天平 上海力辰科技有限公司；DHG-9030A电热鼓风干燥箱 上海一恒有限公司；YTLG-12B真空冷冻干燥箱 上海叶拓有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 基本营养成分的测定 灰分、脂肪、蛋白质、VC、水分等含量的测定分别参照GB/T 5009-2016《食品安全国家标准》[21]中“食品中总灰分的测定方法”、“酸水解法测定脂肪”、“凯氏定氮法测定蛋白质”、VC含量测定中的第一法、水分含量测定中的第一法；粗纤维含量的测定采用GB/T 8310-2013[22]中的方法；还原糖及总糖含量的测定分别采用3,5-二硝基水杨酸标准曲线法和苯酚-硫酸标准曲线法[23]；果胶含量的测定采用水提醇沉法[24]；矿物元素含量的测定采用高压微波消解果皮，用电感耦合等离子原子发射光谱法（Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry，AES-ICP）[25]。

本研究采用文良娟等[26]研究的西番莲果皮中的部分营养成分与所测的三叶木通果皮营养成分进行对照，并计算其差异百分率，比较两种不同类型果皮中各营养成分含量的差异。差异百分率按公式（1）计算：

1.2.2 功能活性成分的提取与含量测定

1.2.2.1 果皮提取物的制备 三叶木通果皮置于干燥箱内50 ℃下烘干，粉碎过40目筛。按两种料液比（1:15和1:10 g/mL）依次用75%乙醇溶液于80 ℃下各回流提取2次，2 h/次，滤液合并，减压浓缩，浸膏于冷冻干燥机内冻干，称重。取适量冻干品，用80%乙醇微热溶解，配制成0.1 mg/mL冻干样液待用。

1.2.2.2 总黄酮含量的测定 以芦丁为标品，采用亚硝酸钠-三氯化铝法[27]，510 nm处测定吸光值，制作芦丁标准曲线。取1 mL冻干样液，同法显色，由芦丁标准曲线回归方程（y=0.009x+0.0026，R2=0.9993）计算样液中总黄酮含量。果皮样品中总黄酮的含量按公式（2）计算：

式中，n：稀释倍数；wa：果皮提取物冻干后的质量，g；wb：三叶木通果皮干重，g；c：冻干液中活性成分（总黄酮、总酚、总皂苷）的浓度，mg/mL；0.1为0.1 mg/mL冻干样液。

1.2.2.3 总酚含量的测定 以没食子酸为标品，采用Folin-Ciocalten 法[27]，765 nm处测定吸光值，制作没食子酸标准曲线。取1 mL冻干样液，同法显色，由没食子酸标准曲线回归方程（y=0.1656x+0.0155，R2=0.9994）计算样液中总酚含量。果皮样品中总酚的含量按公式（2）计算。

1.2.2.4 总皂苷含量的测定 以齐墩果酸为标品，采用香草醛-高氯酸法[28]，550 nm处测定吸光度，制作齐墩果酸标准曲线。取1 mL冻干样液，同法显色，由齐墩果酸标准曲线回归方程（y=9.8854x−0.0306，R2=0.9996）计算样液中总皂苷含量。果皮样品中总皂苷的含量按公式（2）计算。

1.2.3 抗氧化活性测定

1.2.3.1 不同质量浓度果皮提取液的配制 80%乙醇对冻干样液（0.1 mg/mL）进行逐级稀释，配制不同质量浓度的果皮溶液（以下简称样液）。

1.2.3.2 三叶木通果皮提取物对DPPH自由基的清除能力 取 0.5 mL 样液，加入2.5 mL DPPH乙醇溶液（0.1 mmol/L），黑暗处缓慢摇动30 min，517 nm处测定吸光度[29−30]，VC作对照。DPPH自由基的清除率计算公式如下：

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式中，A2：0.5 mL样液与2.5 mL DPPH乙醇液混合后的吸光度；A1：0.5 mL样液与2.5 mL乙醇混合后的吸光度；A0：2.5 mL DPPH溶液与0.5 mL乙醇混合后的吸光度（A0）。

1.2.3.3 三叶木通果皮提取物对ABTS+自由基的清除能力 ABTS工作液的配制[29−30]：取5 mL ABTS溶液（7 mmol /L）与88 μL K2S2O8溶液（40 mmol /L）混均，室温避光放置14 h，80%乙醇稀释之使其在734 nm处的吸光度达到0.7左右，成为ABTS工作液。

测定方法[29−30]：取0.3 mL的样液和2.7 mL的ABTS工作液充分混匀，室温下避光反应10 min，在734 nm处测定吸光值，VC做阳性对照。清除率按如下公式计算：

式中，A2：0.3 mL样液和2.7 mL ABTS工作液混合后的吸光度；A1：0.3 mL样液与2.7 mL 80%乙醇混合后的吸光值；A0：2.7 mL ABTS工作液与0.3 mL 80%乙醇混合后的吸光值。

1.3 数据处理

数据用Origin 8.0进行处理并绘制图表，相关性分析使用SPSS 19.0 软件，各营养成分及活性成分的含量均平行3次实验，以平均值±标准差表示试验结果。

2 结果与分析

2.1 基本营养成分含量

因西番莲果是目前流行的一种营养价值和药用价值较高的水果，已普遍被大众所认可和喜爱，目前已被广泛开发和利用[31]。但三叶木通果皮还处于刚刚开发阶段，其附加值较低，本研究与西番莲果皮中的营养成分进行对照，旨在为三叶木通产品的开发利用提供理论依据。本研究通过计算西番莲果皮和三叶木通果皮中部分营养成分含量的差异百分比，可以直观对比二者营养成分含量的差异。由表1可知，三叶木通果皮中除粗纤维含量（16.00%±0.03%）低于西番莲果皮（21.1%），二者之间的差异百分比为−24.17%外，其余所检测的营养成分含量均高于西番莲果皮。三叶木通果皮中脂肪含量（2.45%±0.21%）远高于西番莲果皮（0.56%），其差异百分比达+337.50%；蛋白质含量几乎是西番莲果皮的2倍，其差异百分比达到+68.60%；三叶木通果皮中果胶含量（20.08%±0.20%）也高于西番莲果皮（12.50%），二者差异百分比达到+60.64%。两种不同种类的果皮中，还原糖的含量接近，差异百分比为+9.72%，但三叶木通果皮中总糖含量（32.61%±0.18%）高于西番莲果皮中总糖的含量（22.60%），二者的差异百分率为+44.30%。三叶木通果皮中水分的含量为 8.65%±0.02%，VC的含量极低，未被检出。两种果皮的部分营养成分对比结果表明，三叶木通果皮中的营养成分含量高于西番莲果皮，在果茶、果酱、果胶等产品的开发中优势更加明显。该结果可为三叶木通果皮的开发利用提供理论依据。

表1 三叶木通果皮中主要营养成分含量（%）Table 1 Contents of nutritional components in Akebia trifoliate pericarp (%)

2.2 矿物元素含量

本研究对三叶木通果皮中的营养元素K、Ca、Mg、Fe、Na、Mn、Cu、Zn等含量进行了测定，结果显示（见图1），三叶木通果皮中不仅含有丰富的人体必需常量元素 K、Ca、Mg 和 Na，而且含有人体代谢必需的微量元素 Fe、Cu、Zn和Mn 。所测得的8种矿质元素含量顺序依次为K>Ca>Mg>Fe>Mn>Na>Cu>Zn。其中，K元素含量最高（14061.17±105.21 μg/g DW），其次是Ca （4959.28±55.00 μg/g DW）、Mg （1727.57±25.34 μg/g DW）和Na（58.36±1.57 μg/g DW）。微量元素Fe、Cu、Mn和Zn含量分别为95.58±1.05、7.9124±0.05、69.58±0.24和 6.0914±0.02 μg/g DW。矿质元素是人体新陈代谢及生长发育不可缺少的营养成分，缺失会导致身体发育迟缓和疾病的发生[32]。所测的8种矿质营养元素含量虽不及王莹等[33]研究的百香果皮中各营养元素的含量高，但均比陈媚等[34]研究的大果西番莲果皮和张莉等[35]研究的苹果皮中高的多，与刘红昌等[36]通过原子吸收光度法测定的贵州其他地区三叶木通果皮相比，除Na、Cu、Zn 元素含量差异较大外，其余5种元素含量相差均较小。说明果皮中部分矿物元素的含量虽然受生态环境的影响，但大多数营养元素含量由遗传因素所决定。因此，三叶木通果皮可作为特色新品种的研发对象和功能产品材料进行加工利用。

图1 三叶木通果皮中8种矿物元素的含量Fig.1 Contents of eight mineral elements in the pericarp ofAkebia trifoliata

2.3 各功能活性成分含量

表2 三叶木通果皮中活性成分含量 （mg/g DW）Table 2 Content of active ingredients in Akebia trifoliatepericarp (mg/g DW)

2.4 三叶木通果皮抗氧化活性评价

2.4.1 三叶木通果皮提取物对DPPH和ABTS+自由基的清除能力 本研究以VC为阳性对照（图2A），考察果皮提取物在不同浓度梯度下对DPPH和ABTS+自由基的清除能力。图2B可知，三叶木通果皮提取物对DPPH·有一定的清除能力，在实验浓度范围内（0.01～0.085 mg/mL）呈良好的量效关系，在浓度为0.085 mg/mL时，其清除率达到84.81%；通过对提取物浓度的对数与清除率概率单位进行线性拟合，得到的拟合方程y=2.7269x+8.5712，R2=0.9835，IC50的值计算后为0.049 mg/mL，该结果与罗宗洪等[10]对云南三叶木通果皮（IC50=53.56 μg/mL）的测试结果相近，说明相同的物种在生长发育过程中其活性物质的功能作用主要由遗传因素决定。

图2 三叶木通果皮提取物对DPPH·的清除能力Fig.2 Scavenging capabilities to DPPH· from different concentrations of extracts from Akebia trifoliate pericarp

图3B可知，三叶木通果皮提取物对ABTS+自由基也具有一定清除能力，且随着提取物浓度的升高，清除能力逐渐增强，表明提取物浓度与清除ABTS+自由基能力呈正向量效关系。利用Origin对提取物浓度对数与清除率概率单位进行线性拟合，其拟合方程为y=2.8403x+8.6663，R2=0.9828，IC50为0.052 mg/mL，该结果比罗宗洪等[10]用同法测定的云南三叶木通果皮（IC50=42.25 μg/mL）略高。但清除能力不及VC（在实验最低浓度时半数清除率已高于50%）（图3A）。

图3 三叶木通果皮提取物对ABTS+·的清除能力Fig.3 Scavenging capabilities to ABTS+· from different concentrations of extracts from Akebia trifoliate pericarp

细胞内积累大量的活性氧自由基，可造成细胞坏死与组织损伤，破坏核酸的结构，引起DNA突变等，是人体衰老和患病的根源[39−40]。本实验结果显示，三叶木通果皮提取物对DPPH、ABTS+等自由基均有一定的清除能力，该研究结果可为贵州三叶木通果皮的深度开发提供一定的参考。

2.4.2 抗氧化活性成分与抗氧化能力相关性 对不同质量浓度提取物中各活性成分的含量及自由基清除率进行测定，利用 Spearman函数对各活性成分与抗氧化能力间的相关性进行分析。研究结果发现，各活性成分含量与清除DPPH、ABTS+自由基能力之间存在极显著相关性（P<0.01）（表3），此外，三种活性成分之间的相关性也达到极显著水平。

表3 三叶木通果皮提取物活性成分与抗氧化能力相关性Table 3 Correlations between antioxidant contents and capabilities from pericarp extracts of Akebia trifoliate

3 结论

本研究以贵州铜仁谢桥镇野生三叶木通果皮为原料，对其营养成分及活性功能成分进行测定分析，并评价了果皮提取物对DPPH和ABTS+自由基的抗氧化活性。研究结果表明，三叶木通果皮中含有较丰富的蛋白质、脂肪及矿质元素。其活性成分总黄酮、总酚及总皂苷含量远远高于多数药食同源植物，其中，总酚含量为（31.53±0.18）mg/g DW，总黄酮和总皂苷含量分别达到（20.58±0.12）mg/g DW和（45.20±12.04）mg/g DW。抗氧化实验显示，果皮提取物对DPPH和ABTS+自由基有较强的清除能力，并和浓度有显著的量效关系。Spearman相关性分析表明，总皂苷、总酚和总黄酮等含量与抗氧化能力呈正相关。本研究结果不仅可为贵州铜仁地区的野生三叶木通资源的开发利用提供一定的理论支持，而且为三叶木通产业链的延伸及产品的深度开发提供了一定的参考。