王会伟 姜伟伟 徐媛,3 李颖芳,4 李航 朱信霖 陈天杨 王启龙 陈敏 潘炜华 廖万清

(1.海军军医大学上海长征医院皮肤科，上海 200003；2.上海市医学真菌分子生物学重点实验室，上海 200003；3. 杭州市第三人民医院皮肤科，杭州 310009；4.上海市皮肤病医院皮肤科，上海 200443；5. 69218部队医院，喀什 844799)

Fonsecaeaspp.所致的暗色真菌病(dark fungal disease，DFD) 是累及皮肤、皮下、内脏和中枢神经系统等部位的慢性真菌感染性疾病[1]。近20年来，Fonsecaeaspp.感染的发病率逐年增加[2]，感染后需要长期系统的药物治疗[1]，尤其是合并脑部感染患者预后差，死亡率高达90%[3-4]。DFD 临床表现的多样性，给诊断带来很大困难。而大部分Fonsecaeaspp.菌株对两性霉素B、氟康唑这些药物的敏感性较低，有不同程度的抗药性[5-7]，导致Fonsecaeaspp.感染后病程时间长、复发率高，进而又增加耐药性。目前Fonsecaeaspp.感染的治疗方案尚无统一的“金标准”，即使联合治疗，有些患者仍然效果欠佳，该病的治疗一直困扰着临床医生与广大的患者[8]。拟对收集自我国的Fonsecaeaspp.临床菌株进行体外药敏检测研究与系统分析，为精准治疗方案的制定提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

32株Fonsecaeaspp.临床株来自上长征医院真菌室菌种库(2株)，部分由中国医学科学院皮肤病医院刘维达教授(10株)、南方医科大学孙逸仙医院席丽艳教授(10株)、复旦大学附属华山医院章强强教授(2株)和广西医科大学曹存巍教授(10株)惠赠。所有菌株均分离自各地患者皮肤感染部位，其中Fonsecaeamonophora18株，Fonsecaeanubica7株，Fonsecaeapedrosoi9株(2株菌活化后期发现污染，排除)。

1.2 研究方法

采用美国临床实验室标准化委员会推荐的丝状菌标准的肉汤微量稀释法(CLSI M38-A2 法)，对Fonsecaeaspp.分离株进行11种临床抗真菌药物的体外敏感性试验[8]。

表1 本研究中使用的抗真菌药物列表的详细信息

将Fonsecaeaspp.菌株接种于PDA培养基(全部使用第2次活化菌株)，置于35℃恒温恒湿培养箱中孵育，5 d后观察，以近平滑念珠菌(ATCC 22019)作为参考菌株。

药敏板的制备[8]使用96孔板(U型底)作为药敏板，每块药敏板为同1种抗真菌药物，每株菌重复1次(共2排)，故一块药敏板可对4株Fonsecaeaspp.菌株的抗真菌药物敏感性进行检测。药敏板中每列抗真菌药物的浓度相同，1～10孔以2倍的浓度递减，11孔为阳性对照孔不含药物，第12孔为阴性对照，药母液浓度为1 600 μg/mL，第1孔的中间浓度应为16 μg/mL。本实验研究药敏板的2孔至10孔不使用伏立康唑母液直接配制，先用DMSO对1 600 μg/mL的伏立康唑母液稀释至药敏板上对应孔所需浓度的50倍，然后使用1 640培养基将50倍浓度的伏立康唑药调整为该孔所需浓度。最后分别往阳性、阴性对照孔中每孔加入100 μL、 200 μL上述溶液用作后续对照。将配制好的伏立康唑药敏板标注日期及药物名称后放入-40℃冰箱备用。见图1。

图1 两性霉素B的药敏实验设计方案与结果示例

菌悬液的制备[8]用枪头吸取10 μL孢子悬液滴在血球计数板盖玻片边缘，在显微镜下观察血球计数板上的Fonsecaeaspp.孢子分布是否均匀，然后进行计数，计算4个顶角和最中间方格中的Fonsecaeaspp.孢子数量(压线部位计数时应“数上不数下，数左不数右”)，数得Fonsecaeaspp.孢子数为N，则Fonsecaeaspp.菌的总浓度=5×N×104CFU/mL，最终菌的总浓度应控制在3×106CFU/mL[8]。使用1 640培养基对计数得到的Fonsecaeaspp.孢子悬液进行稀释，最终将孢子悬液浓度稀释至4×104～5×103CFU/mL(3×104CFU/mL)后，加入配制好的96孔抗真菌药板中，1～11孔各加入100 μL孢子悬液，每种菌加两排进行重复对照[8]。ATCC 22019质控菌株菌悬液的配制：挑取单菌落至装有Tween 20生理盐水的EP管涡旋震荡充分混匀，取菌悬液计数，计数方法同上述Fonsecaeaspp.计数方法[8]。用1 640培养液将该质控菌株菌悬液浓度调整至1×103～5×103CFU/mL(3×103CFU/mL)后，接种至药敏板(接种方法同Fonsecaeaspp.)[8]

1.3 全球Fonsecaea spp.感染病例相关临床株药敏数据收集

搜索PubMed、中国知网(CNKI)、中国生物医学文献服务系统(SinoMed)。研究方案获得PROSPERO注册号：CRD42021275308[9]。主要诊断标准：①用10%的KOH直接观察，发现样本中深色的厚壁硬壳小体(“copper pennies)[9]；②患者组织中分离、培养后ITS 测序鉴定。结局变量为好转与未好转。统计报道的时间点Fonsecaea感染预后为：①治愈(临床治愈与真菌学检查治愈)或者好转；②未好转或致死。

1.4 统计学方法

连续变量(年龄和时间等)以平均值±标准偏差表示；分类变量(包括性别等)以计数和百分数表示，组间差异比较采用非参数秩和检验 Wilcoxon。统计假设的所有检验都是双向，P<0.05被认为具有统计学意义。使用R语言(版本3.6.3 /Windows 64位)分析所有数据并作KM曲线。

2 结 果

2.1 Fonsecaea spp.临床分离菌株的体外药敏实验结果

对32株Fonsecaeaspp.的体外药敏试验结果见表2，Fonsecaeaspp.对POS(MIC50=0.25 μg/mL，MIC90=0.5 μg/mL)，ISA (MIC50=0.25 μg/mL, MIC90=0.5 μg/mL)，VOR(MIC50=0.125 μg/mL, MIC90=0.25 μg/mL)等二代唑类的抗真菌药对Fonsecaeaspp.临床株活性最高，而AmB(MIC50=4 μg/ml；MIC90=8 μg/mL)、FLU(MIC50=8 μg/mL，MIC90>8 μg/mL)、棘白菌素类(MEC50=8 μg/mL, MEC90>8 μg/mL)对Fonsecaeaspp.的抗菌活性较低。POS>ISA>VOR>ITR>FLU；Ani>CAS> MCF。

表2 Fonsecaea spp.临床分离菌株的体外药敏实验结果

2.2 Fonsecaea spp.药敏系统分析

搜索到已报道的83个Fonsecaeaspp.病例的药敏实验结果，其中Fonsecaeapedrosoi34株(34/83，40.96%)，Fonsecaeamonophora36株(36/83，43.37%)，Fonsecaeanubica13株(13/83，15.66%)，统计分析MIC50结果见表3。在Fonsecaeaspp.(n=83)的药敏结果中POS> TRB> VOR> ITR >CAS> AmB>5-FC> FLU。在Fonsecaeamonophora(n=36)的体外药敏实验中，POS> TRB> VOR> ITR >CAS> AmB>5-FC> FLU。在Fonsecaeapedrosoi(n=34)的体外药敏实验中，TRB> POS> VOR> ITR> AmB> CAS> 5-FC>FLU。在Fonsecaeanubica(n=13)的体外药敏实验中，POS> TRB> VOR> ITR> CAS> AmB>5-FC> FLU。

表3 已报道的83个Fonsecaea spp.病例的药敏实验结果

2.3 Fonsecaea spp.临床分离菌株的种间临床预后分析

根据收集的临床病例资料进行分析，如图2所示，以目前的临床治疗措施，Fonsecaeamonophora和Fonsecaeanubica的应答率明显好于Fonsecaeapedrosoi，对药物的有效率依次由高到低位：Fonsecaeamonophora，Fonsecaeanubica，Fonsecaeapedrosoi。

图2 Fonsecaea spp.所致的暗色真菌病的临床有效情况

3 讨 论

1911年，Pedroso在巴西首次报道了Fonsecaeapedrosoi感染的病例[9]。近20年来，全球报道的Fonsecaeaspp.感染的病例呈逐年上升的趋势。我国已成为Fonsecaeaspp.感染最多的区域之一，尤其高发于我国华南、华东区域，长江与黄河中下游流域等地区。鉴于DFD临床表现的多样性，其诊断依赖于实验室真菌学检查结果，临床医生不仅需要排除许多常见的疾病，如疣状结核、银屑病、鳞癌等非真菌感染的常见疾病外，还需要与枝孢瓶霉属(Cladophialophoraspp.)、瓶霉属(Phialophoraspp.)、喙枝孢属(Rhinocladiellaspp.)和外瓶霉属(Exophialaspp.)等暗色真菌所致的暗色真菌病进行鉴别[9]。本研究发现国内外Fonsecaeaspp.所致的暗色真菌病的诊断，仍然有很多病例误诊，另外也有很多病例不能进行Fonsecaeaspp.种水平的鉴定，导致不能及时有效地“对菌下药”。在目前的临床治疗方案下，Fonsecaeamonophora(除神经系统感染外)的应答率明显好于Fonsecaeapedrosoi和Fonsecaeanubica，对药物的有效率依次由高到低位：Fonsecaeamonophora，Fonsecaeanubica，Fonsecaeapedrosoi(Fonsecaeapedrosoi与非Fonsecaeapedrosoi之间有差异)。Fonsecaeaspp.感染的致病菌种精确至种水平的诊断，有利于精准选择治疗方案，提高患者治愈率。

本研究所收集的Fonsecaeaspp.菌株，几乎所有的菌株均对AmB、FLU耐药，且药物敏感性较国外研究更低[6,10]，唑类抗真菌药物对Fonsecaeaspp.的抗菌活性较高，除了氟康唑以外，其他唑类药对Fonsecaeaspp.均有抗菌活性，尤其是POS对Fonsecaeaspp.的活性最强，表明POS在Fonsecaeaspp.感染的治疗中有良好的应用前景[11]。棘白菌素类药物对Fonsecaeaspp.的抗菌活性略高于两性霉素B，但低于大部分唑类药物。由于棘白菌素类药物作用于细胞壁及低毒性的特点，在联合其他抗真菌药物治疗Fonsecaeaspp.时具有潜力。由于常用抗真菌药对Fonsecaeaspp.的抗菌活性并不很理想，活性较高的二代唑类药又价钱昂贵，进一步研究针对Fonsecaeaspp.的联合药敏具有重要意义。有研究表明AmB与5-FC联合使用对F.monophora菌株具有协同作用[10-11]。本研究分析也发现TRB与AmB可能有协同作用，有助于临床治疗率的提高，在降低不良反应的同时可降低真菌耐药率的发生。

综上，本研究结果提示，针对Fonsecaeaspp.感染的抗真菌治疗策略，首先推荐选择POS, ISA, VOR等二代唑类药物。其他抗真菌药物TRB、ITR、AmB、FLU等对分离自我国的Fonsecaeaspp.临床分离菌株的体外抗真菌活性有降低趋势，需要持续监测。Fonsecaeaspp.临床分离菌株的体外联合药敏特征亦值得进一步研究。