章菲菲 毛凌燕 蔡娟 王慧君

201103 中国人民武装警察部队上海市总队医院内二科，上海

结直肠癌是发生于结直肠上皮的恶性肿瘤，全球范围内，结直肠癌是第三位常见的恶性肿瘤，也是第二位常见的恶性肿瘤死亡原因[1]。《2020年中国癌症统计数据》显示，结直肠癌的发病率高居第二位，发病率呈逐年上升趋势[2]。在一定情况下，肠道微生态和内环境的改变可诱发结肠癌，导致肿瘤进展。人体只有在肠道微生态的种类、数量和比例保持平衡的前提下，才能维持正常的肠道内环境[3]。有研究显示，经大肠癌患者的粪便灌胃给药后，小鼠可发生肠肿瘤和肠上皮发育不良，为大肠癌患者肠道菌群的促瘤作用提供了直接证据[4]。近年来，已证实肠道菌群与大肠癌的发生、发展和治疗有关，潜在的致病菌和代谢标志物的发现将有助于结直肠癌患者的早期诊断和有效治疗[5]。本研究拟通过结直肠癌患者和正常人群肠道菌群的检测和比较，探寻肠道菌群在肿瘤患者中的变化特点。

资料与方法

选取2014年10月-2019年12月中国人民武装警察部队上海市总队医院诊治的结直肠癌患者8例为病例直肠癌组。12名正常人为对照组。

本研究病例组共有患者8 例(一般资料详见表1)，其中男1 例，女7 例；年龄23～69 岁，平均(53.63±14.99)岁。正常对照组男5 人，女7 人；年龄35～68岁，平均(49.17±9.16)岁。两组一般资料具有可比性。

表1 病例组患者的一般资料

纳入标准：初次确诊结直肠癌。

排除标准：检查前1 个月内服用过抗生素或微生态制剂。既往有糖尿病、慢性肝肾疾病史或恶性肿瘤史。

方法：通过粪便高通量测序进行肠道菌群检测。(1)样本收集：用清洁容器收集研究对象的新鲜粪便3 g，液氮保存送检。(2)脱氧核糖核酸(DNA)抽提和聚合酶链反应(PCR) 扩增：根据e.z.n.a®土壤DNA 试剂盒(Omega-Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)说明对粪便进行微生物群落总DNA 提取，DNA 提取质量通过1%琼脂糖凝胶电泳判断，同时完成DNA 浓度和纯度测定；用338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')引物通过PCR 扩增16S rRNA 基因的v3-v4 可变区序列。扩增步骤如下：①95℃预变性3 min；②27 个循环(95℃变性30s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s)；③在72℃下稳定延伸10 min；④储存于4℃(PCR 仪器：ABI GeneAmp®9700 型)。PCR 反应体系：5×缓冲液(Trans Start Fast Pfu)4 μL，2.5 mM 脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)2 μL。上游引物1(上游，5 μM)0.8 μL。引物2(下游，5 μM)0.8 μL。DNA 聚合酶(Trans Start Fast Pfu)0.4 μL。模板DNA 10 ng，双蒸水ddH2O 补充至20 μL。每个样品重复3 次。(3)Illumina Miseq 测序：PCR 产物通过2%琼脂糖凝胶回收，产物通过Axy Prep DNA 凝胶提取试剂盒(Axygen Biosciences，Union City，USA)纯化，然后通过2%琼脂糖凝胶电泳检测。使用荧光计(美国Promega)定量检测回收产物。使用NEXTflex ™Rapid DNA-seqKit(bio scientific，USA)构建基因组文库：①连接子链接；②磁珠筛选后，移除接头的自连片段；③PCR 扩增富集文库模板；④通过磁珠回收PCR 产物以获得最终的基因组文库。测序由Miseq 高通量测序仪pe300 平台(Illumina)完成(上海美吉生物医学科技有限公司)。(4)数据处理。(5)将Fastp 数据质控软件(https://github. com/OpenGene/fastp ，版本0.20.0)用于原始测序序列的质量控制，使用flash(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash ，版本1.2.7)软件完成基因序列拼接：①过滤读取尾质量值＜20 的碱基，设置50 bp 为窗口，如果窗口中的平均质量值＜20，则从窗口中切断后端碱基，质量控制后过滤50 bp 以下的读取，删除包含N 碱基的读取；②根据PE 读取之间的重叠关系，将成对读取拼接成一个序列，最小重叠区域长度为10 bp；③剪接序列重叠区域的错配率为≤0.2，对不一致序列进行筛选；④根据DNA 序列两端的条形码和引物区分样本，并调整序列方向，DNA 条形码允许错配数为0，引物最大错配数为2。通过uparse 富文本解析器软件( http://drive5.com/uparse/，版本7.1)，并根据97% 相似性标准对序列进行操作分类单元OTU 聚类后移除嵌合体。使用RDP 序列分类器的贝叶斯算法(http://rdp.cme.msu.edu/，版本2.2)注释每个序列的物种分类，并将其与Silva 16S rRNA 微生物多样性数据库(版本138)进行比较。比较阈值设置为70%。

观察指标：病例组和对照组的肠道菌群组成与丰度。

结 果

肠道细菌群落组成与丰度占比差异：柱形图显示，在属水平上病例组与对照组的群落组成与丰度占比有一定的差异。

肠道菌群在属水平上的组间差异：结直肠癌患者存在拟杆菌属、肠杆菌属、梭杆菌属富集现象，但产丁酸盐细菌减少。见图1。

图1 病例组与对照组肠道菌群构成柱形图

结直肠癌患者存在独特的菌属：维恩(VENN)图显示，结直肠癌患者含有的独有物种存在4类独特的菌属：伯克氏菌、黄杆菌、颤螺旋菌、未分类蓝藻，可能属于病原菌/条件致病菌。见图2。

图2 病例组和对照组中的独有菌属(VENN图)

讨 论

现有证据显示，结直肠癌、肠道腺瘤的发生都与肠道微生态有关，因此通过分析结直肠良恶性肿瘤患者的肠道菌群结构，筛选出具有结直肠癌、结肠腺瘤患者的特征性菌群组成，可能对结直肠肿瘤的诊断和防治有临床参考价值[6-7]。目前认为患者肠道中具核梭杆菌、粪肠球菌、大肠杆菌、肠杆菌属脆弱类杆菌作用于致癌信号通路及关键基因，与结直肠癌的发生密切相关[8]。肠道菌群可以通过各种方式促进结直肠癌的发展，如在诱发慢性炎症的基础上，通过炎症信号通路导致肿瘤的发生，通过氧自由基、毒性代谢物和致癌物的合成，影响宿主的代谢，诱发DNA 的损伤，从而改变干细胞动力学和调节细胞凋亡。

本研究样本量虽然较少，但肠道菌群多样性检测结果与现有研究一致，病例组的粪便标本存在下列特点：①肠道菌群中产丁酸盐细菌明显下降；②拟杆菌属、肠杆菌属和梭杆菌属富集现象。本研究同时还发现结直肠癌患者存在四类独特的菌属：伯克氏菌、黄杆菌、颤螺旋菌、未分类蓝藻，可能属于病原菌/条件致病菌。基于现有研究结果，调查结直肠肿瘤患者的肠道菌群结构变化有望为结直肠癌的诊断、生物标志物和治疗干预策略提供有价值的信息[9]。具核梭状芽孢杆菌与结直肠癌的研究结果表明，肠道菌群有望成为结直肠癌及其癌前疾病早期筛查的标志物，并有助于发现高危人群；利用微生态学及其代谢产物可以预测结直肠癌及其癌前病变的预后；以微生态学及其代谢产物为靶点，也为大肠癌及其癌前疾病的防治提供了新的思路和方向。由于肠道菌群的数量庞大，影响因素众多，这给研究造成了很大的困难。随着宏观基因组学及二代测序等新技术的发展，结直肠肿瘤与肠道微生态的关系将得以进一步明确，有望为结直肠癌防治策略提供新的理论依据。粪菌宏基因组测序很可能成为结直肠癌非侵入性的标记物[10]。拟通过宏基因组学对结肠肿瘤患者肠道菌群进行分析，同时增加样本量和细化分层因素，以期得到更有针对性的结果。