罗婷婷 孙祥灵 赵昆 段国梅 李土桂 何秋星

中国素有“一白遮三丑”的审美观念，追求“肤如雪，凝如脂”历来是中国女性关注的热点话题。目前，大多数美白剂的美白作用机制主要通过抑制酪氨酸酶活性、阻断黑色素合成过程、加速黑色素角质细胞脱落、抑制黑色素向角质细胞迁移、清除自由基等方面来改善皮肤黑色素沉着、肤色暗沉等问题[1-2]。因此，美白型护肤品在化妆品领域的研究中具有较为广阔的市场和发展潜力。

实验部分

01试剂与仪器

烟酰胺、熊果苷、维生素C、凝血酸、光甘草啶、谷胱甘肽、白藜芦醇，广州品赫生物技术有限公司;FeSO4、水杨酸，天津市福晨化学试剂厂;三羟甲基氨基甲烷，上海润捷化学试剂有限公司;DPPH、邻苯三酚、酪氨酸酶，上海宝曼生物科技有限公司;B16小鼠黑色素瘤细胞株，北京北纳创联生物技术研究院;DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清，美国Gbico公司;DMSO、MTT、TritonX-100，美国MPBiomedicals公司。

UV-2600，CH紫外分光光度计，岛津公司;SC-3610低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司;二氧化碳细胞培养箱，上海圣科仪器设备有限公司;InfiniteM200PRO酶标仪，帝肯贸易有限公司。

02实验方法

2.1单因素试验

将维生素C（0.10、0.12、0.14、0.16、0.18mg/mL）、白藜芦醇（0.04、0.08、0.12、0.15、0.20mg/mL）、谷胱甘肽（0.03、0.05、0.08、0.10、0.12mg/mL）、光甘草叮（0.05、0.08、0.10、0.12、0.15mg/mL）、凝血酸（0.02、0.05、0.08、0.12、0.14mg/mL）、熊果苷（0.25、0.30、0.35、0.40、0.45mg/mL）和烟酰胺（0.14、0.16、0.18、0.20、0.25mg/mL）分别以DPPH自由基清除率为指标，考察7种美白原料的浓度对DPPH自由基的抗氧化作用，根据其结果筛选出对DPPH自由基清除效果最好的3种美白原料，其为组合1。

将维生素C（0.05、0.10、0.16、0.18、0.20mg/mL）、白藜芦醇（0.04、0.06、0.08、0.10、0.12mg/mL）、谷胱甘肽（0.10、0.12、0.14、0.17、0.20mg/mL）、光甘草叮（0.10、0.12、0.14、0.18、0.20mg/mL）、凝血酸（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL）、熊果苷（0.08、0.15、0.20、0.30、0.40mg/mL）和烟酰胺（0.30、0.35、0.40、0.45、0.50mg/mL）分别以羟自由基清除率为指标，考察7种美白原料的浓度对羟自由基的抗氧化作用，根据其结果筛选出对羟自由基清除效果最好的3种美白原料，其为组合2。

将维生素C（0.05、0.08、0.12、0.16、0.18mg/mL）、白藜芦醇（0.15、0.25、0.35、0.45、0.50mg/mL）、谷胱甘肽（0.10、0.15、0.20、0.25、0.35mg/mL）、光甘草叮（0.10、0.12、0.14、0.18、0.20mg/mL）、凝血酸（0.08、0.10、0.20、0.30、0.40mg/mL）、熊果苷（0.08、0.15、0.20、0.30、0.40mg/mL）和煙酰胺（0.30、0.35、0.40、0.45、0.50mg/mL）分别以超氧自由基清除率为指标，考察7种美白原料的浓度对超氧自由基的抗氧化作用，根据其结果筛选出对超氧自由基清除效果最好的3种美白原料，其为组合3。

2.2正交试验

根据2.1的单因素试验结果，确定3组实验方案的L9（34）正交试验，以清除率作为指标，确定3种复配原料的最佳配比，具体实验安排见表1、表2、表3。全文以下简称DPPH自由基清除试验为组合1、羟自由基清除试验为组合2、超氧自由基清除试验为组合3。

2.3抗氧化活性测定

（1）DPPH自由基清除试验的测定方法[3]。用50%乙醇的配制DPPH溶液（0.2mmol/L），精密移取表4中各组反应液于5mLEP管中，混合后充分摇匀，避光反应30min后，置于517nm处测定其吸光度，平行实验3次，计算其清除率。DPPH自由基清除率（%）=1-（Ai-Aj）/Ao×100%

羟自由基清除试验的测定方法[3]。分别配制9.0mmol/LFeSO4溶液、9.0mmol/L水杨酸乙醇溶液、8.8mmol/LH2O2溶液。精密移取表5中各组反应液于5mLEP管中，混合后充分摇匀，再加入H2O2溶液，于37℃下反应30min，置于510nm处测定吸光度，平行实验3次，计算其清除率。羟自由基清除率（%）=1-（Ai-Aj）/Ao×100%

（3）超氧阴离子自由基清除试验的测定方法[4]。取Tris-HCl缓冲液3mL与去离子水2.8mL混匀，记为1管;取Tris-HCl缓冲液3mL，去离子水1.8mL与样液1mL混匀，记为2管。25℃下反应20min，再分别加入邻苯三酚0.2mL，于319nm处每30s测一次，连续测4min后测定1、2管吸光度，记为△A1、△A2，平行实验3次，计算清除率。清除率（%）=1-（△A2/△A1）×100%

2.4酪氨酸酶活性抑制率测定试验

酪氨酸酶抑制率的测定方法[5]。

2.5B16细胞活性测定

取对数期生长的B16细胞，调整细胞浓度为3×104个/mL接种于96孔板中，每孔加入培养基100μL，置于培养箱（37℃，5%CO2）中培养24h。待细胞贴壁后吸弃原培养基，实验组分别加入用培养基将0.03g/mL和0.06g/mL的样液进行等浓度梯度稀释成不同倍数的培养基100μL，对照组加入不含样液的等体积培养基100μL，空白组加入无细胞的培养基100μL，同时设置阳性对照组含熊果苷（0.1mg/mL）、烟酰胺（0.3mg/mL）的培养基稀释液100μL，每组设置3个复孔，继续培养24h。在培养结束前4h，每孔加入5mg/mLMTT溶液100μL，4h后吸出上清液，每孔避光加入DMSO50μL，振荡10min，置于酶标仪测定490nm处的吸光度，取平均值，计算细胞活力。细胞活力（%）=（A样品组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%

2.6B16细胞内黑色素含量测定

取对数生长期细胞接入6孔培养板，每孔加入培养基1mL，置于培养箱（37℃，5%CO2）中培养24h。吸弃上清液，加入不同浓度的样液，处理同2.5，每孔加入1mL，继续培养24h后，用PBS缓冲冲洗，吸出上清液。然后每孔加入0.2mol/L的NaOH溶液1mL，80℃恒温水浴保温1h，置于酶标仪测定405nm处的吸光度，取平均值，计算黑色素的相对含量。黑色素相对含量（%）=（A样品组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%

03数据分析

试验中每组重复3次，取其平均值。实验数据采用SPSS25进行统计学分析，采用Origin2018进行绘图。

04单因素试验结果

4.1DPPH自由基清除试验结果及分析

由表6可知，通过比较七种美白剂对DPPH清除率试验结果表明，清除率最高的为谷胱甘肽，当其浓度为0.05mg/mL，其清除率为75.6%，还原型的谷胱甘肽是由3个氨基酸组成的三肽，其结构中的半胱氨酸残基通过提供电子以达到清除自由基的作用[6，7];次之为光甘草啶，当其浓度为0.15mg/mL时，其清除率为83.2%，光甘草啶为黄酮类化合物，可能是其结构中的酚羟基提供活泼氢质子，能够有效降低自由基的氧化作用[8，9];其次为白藜芦醇，当其浓度为0.15mg/mL时，其清除率为71.8%，有研究表明白藜芦醇可通过与自由基反应阻止自由基进一步链式反应，同时亦可抑制二硫化谷胱甘肽的形成，从而抑制自由基的生成[10，11]。即通过DPPH的清除率初步筛选出组合1的3种原料为：谷胱甘肽、光甘草啶和白藜芦醇。

4.2羟自由基清除实验结果及分析

由表7可知，通过比较7种美白剂对羟自由基清除率试验结果表明，清除率相对较高的为维生素C，当其浓度为0.18mg/mL时，其清除率高达88.7%，可能原因是含有多个酚羟基的维生素C可以捕获自由基反应链中的过氧自由基，阻止自由基链反应，从而清除·OH、·O2-等自由基[7，12];次之为凝血酸，当其浓度为0.06mg/mL，其清除率高达92.1%，凝血酸作为一种蛋白酶抑制剂，能够抑制酪氨酸酶以及黑色素细胞的活性;再次之为白藜芦醇，当其浓度为0.06mg/mL时，其清除率为64.1%。即通过羟自由基的清除率初步筛选出组合2的3种原料为：凝血酸、维生素C和白藜芦醇。

4.3超氧阴离子自由基清除试验结果及分析

由表8可知，通过比较7种美白剂对超氧自由基清除率试验结果表明，维生素C、白藜芦醇和谷胱甘肽的超氧自由基清除率相对较高。当维生素C的浓度为0.18mg/mL，其清除率为98.5%;白藜芦醇的浓度为0.45mg/mL时，其清除率为94.5%;谷胱甘肽的浓度为0.35mg/mL时，其清除率为86.3%。即通过超氧自由基的清除率初步筛选出组合3的3种原料为：维生素C、白藜芦醇和谷胱甘肽。

05正交试验结果与分析

5.1组合1正交试验

由表9可知，组合1中3种复配原料对DPPH自由基清除率的影响效果顺序为白藜芦醇>谷胱甘肽>光甘草啶，最佳组合为A3B1C1，即白藜芦醇：谷胱甘肽：光甘草啶=0.17：0.03：0.10。通过3次验证实验测定最佳组合A3B1C1的DPPH自由基清除率分别为68.86%、70.25%、70.08%，其平均值为69.73%。然而当白藜芦醇：谷胱甘肽：光甘草啶=0.13：0.03：0.10时，其清除率达到73.14%，高于最佳组合A3B1C1的DPPH自由基清除率。由此可得，在组合1中3种原料的复配比例为白藜芦醇：谷胱甘肽：光甘草啶=0.13：0.03：0.10。

5.2组合2正交试验

由表11可知，组合2中3种复配原料对羟自由基清除率的影响效果顺序为凝血酸>白藜芦醇>维生素C，最佳组合为A2B2C1，即白藜芦醇：维生素C：凝血酸=0.06：0.18：0.04，正交试验模型模拟的最佳组合A2B2C1与实验组7结果一致，其羟自由清除率为95.31%。由此可得，在组合2中3种原料的复配比例为白藜芦醇：维生素C：凝血酸=0.06：0.18：0.04。

5.3组合3正交试验

由表13可知，组合3中3种复配原料对超氧自由基清除率的影响效果顺序为维生素C>谷胱甘肽>凝血酸，最佳组合为A2B1C3，即凝血酸：谷胱甘肽：维生素C=0.45：0.32：0.20。通过3次验证实验测定最佳组合A2B1C3的超氧自由基清除率分别为89.50%、88.77%、90.26%，其平均值为89.51%。然而当凝血酸：谷胱甘肽：维生素C=0.38：0.35：0.20时，其清除率达到92.56%，高于最佳组合A2B1C3的超氧自由基清除率。由此可得，在组合3中3种原料的复配比例为凝血酸：谷胱甘肽：维生素C=0.38：0.35：0.20。

06美白功效综合评价

将3种组合再进行酪氨酸酶活性抑制试验、DPPH自由基清除试验、羟自由基清除试验、超氧阴离子自由基清除试验，结果如表15所示，组合2对酪氨酸酶活性的抑制能力、DPPH自由基清除能力以及羟自由基清除能力皆最高，分别为89.61%、94.03%、95.31%;组合1对超氧自由基清除能力最高，其清除率为92.56%。通过综合评价分析，确定组合2为最佳美白剂复配组合，即白藜芦醇：维生素C：凝血酸=0.06：0.18：0.04时，其美白综合效果最好。

07B16细胞试验结果与分析

7.1B16细胞活性试验

由图1可知，质量浓度为0.03g/mL、0.06g/mL的组合2的B16细胞活性试验中，当质量浓度为0.03×10-16g/mL的组合2时，其对B16细胞活力与阳性对照组熊果苷、烟酰胺无显著性差异（P>0.05），而质量浓度为0.06×10-8g/mL的组合2时，对细胞活力有显著性抑制作用（P<0.05），表明该浓度对细胞毒性相对较大。

7.2B16细胞黑色素相对含量试验

由图2可知，质量浓度为0.03×10-16g/mL与0.06×10-8g/mL对B16细胞黑色素的生成具有一定的抑制作用，在统计学上具有显著性差异（P<0.05）。当组合2的质量浓度为0.06×10-8g/mL时，其抑制率为3.77%，低于阳性对照组熊果苷（39.35%）、烟酰胺（41.24%），其抑制黑色素合成的效果相對较差;而质量浓度为0.03×10-16g/mL，其抑制率为35.04%，略低于阳性对照组，表明该浓度对B16细胞有显著的抑制黑色素合成的能力。

结论

本文通过对7种不同美白剂原料进行复配研究，采用单因素试验、正交试验以及综合评价，优选最佳美白复配组合，通过B16细胞试验评价美白复配组合的美白功效，得到以下结论：

1.单因素试验通过测定DPPH自由基、羟自由基以及超氧自由基的清除率，优选出3组美白组合，分别为组合1（谷胱甘肽、光甘草啶、白藜芦醇）、组合2（凝血酸、维生素C、白藜芦醇）、组合3（维生素C、白藜芦醇、谷胱甘肽）。

2.正交试验优选其3组美白组合的最佳复配比例，分别为组合1=0.13：0.03：0.10、组合2=0.06：0.18：0.04、组合3=0.38：0.35：0.20。

3.通过综合评价3组美白组合的酪氨酸酶活性抑制率以及3种自由基清除率，最终优选组合2为最佳美白组合。

4.B16黑色素瘤细胞试验表明，质量浓度为0.03×10-16g/mL时，其抑制黑素色合成的能力相对较好。