孔丽蕊，何大海，周朝琼，李鸿钏，吴风，罗建伟，张艳

(四川省成都市郫都区中医医院，四川 成都，611730)

肾脏疾病的发病率和病死率与肾损伤程度密切相关，而肾功能测量指标在肾脏疾病的诊断、监测以及治疗方面起重要作用，常用于评估肾脏疾病的风险或监测肾损伤患者的损伤程度。生物标志物的生物学变异数据是临床医生判断患者健康与否以及疾病诊断、治疗、预后的重要依据。目前国内外对肾损伤血清标志物生物学变异研究尚不全面，主要为疾病状态下日间生物学变异[1-3]，尚没有对健康群体短期内生物学变异进行规范化、标准化的研究报道。本研究对31名健康志愿者采用新一代的分析方法测定24 h内s-CREA，s-β2MG，s-Cys C，s-NGAL的水平，并对肾损伤血清标志物24 h内的短期生物学变异数据进行研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料

样本来源于成都市郫都区中医医院2019年3月至11月31名健康志愿受试者，其中，男性17名(中位年龄30岁，范围21～54岁)，女性14名(中位年龄33岁，范围18～48岁)。身高、体重、血压、心率、男女性别等构成比差异均无统计学意义(均P>0.05)。

纳入标准：无慢性糖尿病、高血压、甲状腺肿、心脑血管等疾病，无用药史，有稳定的生活。所有参与者均完成问卷调查，以验证其健康状况并收集有关生活方式的信息，并进行相关体检测试，以确保满足所有纳入标准[4]。对符合条件的受试者，保持采血当日正常的饮食(8：00，12：00，19：00)和正常的休息。研究方案经成都市郫都区中医医院伦理委员会批准，并获得每位参与者的书面知情同意。

1.2 方法

以4 h为时间点间隔(0，4，8，12，16，20 h)，24 h内标准化采集6份血液样本。样本收集历时9个月(2019年3月至11月)。血液采集后室温放置30 min，待全血样本自然析出血清后，5 000 r/min离心10 min，血清移入Eppend 管，保存于-70 ℃冰箱中待检。

所有标本在室温下解冻，采用四川省迈克实业有限公司提供的试剂在日立7180全自动生化分析仪上统一测定。检测前对分析仪按照制造商说明进行校准，参与者的所有样品均进行2次测定。s-β2MG，s-Cys C，s-NGAL采用胶乳免疫比浊法测定。s-CREA采用特异性高的肌氨酸氧化酶法测定，方法测量值可以溯源到肌酐测定的最高标准ID-MS方法，测定性能可以满足临床要求。内部质量控制使用2个水平的质控品，CREA批号为48811/45813，由美国伯乐公司提供；β2MG，Cys C批号为68912，NGAL批号为0619021，由四川省迈克实业有限公司提供。

1.3 统计学分析

用student-t检验对男女组平均值的差异进行检验，P<0.05为差异具有统计学意义。用Shapiro-Wilk试验验证测试数据是否符合正态分布，偏态分布数据进行对数转换，采用Dixon WJ准则处理数据离群值，采用Mann-WhitneyU检验对研究变量的性别相关差异进行统计学分析。CVA为同一分析批中重复测定数据获得，CVI和CVG采用具有95%置信区间的嵌套方差分析进行计算，个体指数(II)和参考变化值(RCV)的计算公式为

II=CVI/CVG。

2 结果

2.1 肾损伤血清标志物的变化

31名受试者均完成了24 h内6次样本收集，共186份血液样本。经重复测量后，有372个结果可分析。如方法部分所述，对每个分析物分别进行离群值检测，其中28号s-β2MG被排除在外。肾损伤血清标志物24 h内浓度呈偏态分布，血清标志物浓度变化见图1。

图1 不同性别的肾损伤血清标志物水平分布Fig.1 Distribution of levels of kidney injury biomarkers in men and women

2.2 不同采集时间点、不同性别肾损伤血清标志物水平比较

24 h内不同采集时间点(0，4，8，12，16，20 h)、不同性别间肾损伤血清标志物s-CREA,s-β2MG,s-Cys C，s-NGAL水平比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 不同采集时间点的肾损伤血清标志物水平Table 1 Levels of kidney injury markers detected at different collection time points

2.3 24 h内肾损伤血清标志物水平与性别的关系

24 h内肾损伤血清标志物水平与性别进行比较，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 不同性别24 h内肾损伤血清标志物水平比较Table 2 Comparison of the concentration levels of kidney injury biomarkers within 24 h between the

2.4 肾损伤标志物的BV，RCV和II

肾损伤血清标志物的Mean，CVA，CVI，CVG，RCV和II，男女之间表现出个体差异。见表3。

表3 24 h内肾损伤血清标志物的Mean，CVA，CVI，CVG，RCV和IITable 3 Mean，CVA，CVI，CVG，RCV and II with 95% confidence intervals of the kidney injury biomarkers within 24 h

2.5 CVI，CVG估计值比较

本研究CVI，CVG高于EFLM和历史生物学变异数据库中报告的CVI，CVG估计值，见表4。

表4 生物学变异CVI，CVG估计值比较Table 4 Comparison of the CVI and CVG estimates of the biological variants

3 讨论

生物学变异数据的广泛应用，对测定血清标志物的稳态性和质量提出了较高的要求。欧洲临床化学和实验室医学联合会(European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,EFLM)对血清标志物不同研究组的生物学变异估计值进行荟萃分析，并不断完善生物学变异数据关键评价清单(biological variation data critical appraisal checklist，BIVAC)[5]，建立了人体生物标志物的生物学变异数据库，用于解释临床试验结果和定义分析性能规范(analytical performance specifications，APS)[6-7]。本研究采用EFLM标准和最新检测方法对受试者进行筛查分析。

本研究发现受试者肾损伤血清标志物24 h内浓度呈偏态分布，不同采样时间点间肾损伤血清标志物水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。而男性和女性的水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。CVA由实验室重复测定数据获得，消除了批间分析变异，且确保分析变异的基质稳定。除s-Cys C 外，s-CREA，s-β2MG，s-NGAL的 CVA明显小于1/2 CVI，说明日立7180生化分析仪测定方法分析变异较小，计算的RCV对连续结果的监测是可靠的。而s-Cys C的CVA>1/2CVI，将增加RCV的假阳性结果，后期判读结果时需特别注意。

31名受试者24 h内肾损伤血清标志物的CVI稳定在5%～10%，无性别方面的差异，表明机体代谢处于稳定状态，可能与血清样本浓度源自产生和清除之间的平衡有关。JONKER等[8]曾报道血清肌酐采样间隔之间CVI无明显差异。本研究4种血清标志物生物学变异数据CVI，CVG均高于网站公布数据[9]。s-CREA受肾小管分泌、肌肉质量、年龄与性别的影响，同时，本研究采用标准化的酶法进行CREA水平测定，s-CREA结果较碱性苦味酸法测定结果普遍降低，可能会导致生物学变异数据在理论上高于标准化前研究报告的生物学变异估计数据。s-β2MG，s-Cys C采用免疫比浊法进行测定，除地域环境影响外，方法学是否影响CVI，CVG还有待进一步研究。s-CREA，s-β2MG，s-Cys C的CVG>CVI，对检测结果进行判读时，需要进行针对性别的CVG估算。NGAL是近年来发现的早期诊断肾损伤的新型生物学标志物，具有早期、快速、特异性高、敏感性高、受其他因素影响少的优点，引起了人们的广泛关注，被认为是“肾脏的肌钙蛋白”，可以预测慢性肾脏病的进展，独立于其他潜在的危险因素[10-11]。本研究中s-NGAL 的CVI和CVG分别为11.64%(10.44%～13.16%)和22.20%(17.74%～29.68%)。

个体变异性及参考值的关系可以用II表示，II=CVI/ CVG。当II>1.4时,表示该检验项目个体专一性低，个体间变异小于个体本身变异，任何微小的生理状态变动就会造成指标超过参考值范围，适用于人群筛检。当II<0.6时,表示该检验指标个体专一性高，个体间变异大于个体本身变异，参考区间的参考价值有限，患者可能已经为异常结果却还落在正常参考值范围之内。本研究的所有检测指标II均<0.6，提示肾功能指标的个体特异性较高，个体检测值的分布只出现在区间范围的一小部分，运用生物学变异来进行结果评价较为合适。所以，医生在运用传统参考区间来解释肾功能结果时，还应该考虑到个体内结果的波动，当个体因疾病发生了变化，其结果在数值上的差异应该大于2次测定结果的固有变异值RCV。

由于2个检验结果中存在生物学变异和分析变异，其结果之间的数值差值为固有变化值之和，称为RCV[6,12-13]。在评估检测结果的变化时，当连续检测结果之间的差异超过RCV时，即使结果仍在参考区间内，结果的变化仍具有临床意义。本研究血清样本II<0.6，经典参考值不适用于评估它们的结果，应选择RCV进行结果判读。如s-CREA首次检测为60.4 μmol/L，第2次检测为110.4 μmol/L，根据传统参考区间判断，患者结果都在参考区间内，实际血清水平增加了50 μmol/L(RCV为21.88%)，肾功能可能出现了问题。如果两次检测结果比较小于本实验室的RCV值，即使超出参考值范围，都不必立即确定该结果异常，建议数天后复查。为每个患者定义一个独特的个性化参考区间[14]以指导其临床治疗，被证明既繁琐又昂贵，所以，通过前后结果差异是否大于RCV来判断可能更适合。本研究血清s-CREA,s-β2MG,s-Cys C,s-NGAL的RCV分别为21.88%，29.31%，5.32%，33.09%。

总之，本研究为肾损伤血清标志物s-CREA，s-β2MG，s-Cys C，s-NGAL提供了健康人群24 h内的生物变异数据。CVG>CVI，个体指数II<0.6，肾损伤血清标志物根据RCV进行临床决策更有临床应用价值。