周新崇，易灿，刘进兵

(邵阳学院 食品与化学工程学院,湖南 邵阳,422000)

邵阳市新宁县崀山片区是湖南省脐橙的重要产区。自20世纪70年代大力推广种植脐橙以来[1]，已经成为全国较大的脐橙生产区，是当地农业经济发展的支柱性产业[2]。脐橙皮中含有丰富的黄酮类物质[3]，具有抗氧化、抗炎症、降血压、抗突变等作用[4]。目前，橘皮黄酮提取的主要方法有微波提取[5-6]、超声提取[7-8]、微切辅助提取[9]。本试验采用响应面法对崀山脐橙皮总黄酮的微波提取工艺进行了优化，并进行了抗氧化活性测定。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

崀山脐橙皮粉 (采摘自湖南省邵阳市新宁县白沙镇白沙园艺场12月成熟期的崀山脐橙果，取其果皮在 60℃ 恒温干燥至恒重，粉碎过孔径为0.25 mm的筛)；芦丁对照品(纯度98%)(中国食品药品检定研究院)；Al(NO3)3(分析纯) 和 NaNO3(分析纯) (天津博迪化工有限公司)；氢氧化钠(分析纯)(天津市大茂化学试剂厂)；无水乙醇(分析纯)(重庆万盛川东化工有限公司)。

1.2 仪器与设备

101-1AB烘箱(天津市泰斯仪器有限公司)；SF-130型高速中药粉碎机(中南制药机械厂)；ME203E型分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；MCR-3常压微波化学反应器、SHB-ⅢA循环水式真空泵(巩义市中天仪器科技有限公司)；SB-5200DT 超声清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；UV-2600紫外可见分光光度计(岛津(上海)实验器材有限公司)。

2 试验方法

2.1 芦丁标准曲线的绘制

标准曲线绘制参考文献[10-11]。精密称取干燥芦丁标准品5.0 mg，烧杯溶解后置于50 mL的容量瓶中，用体积分数 70% 乙醇溶液定容，摇匀，既得质量浓度为0.10 mg/mL的芦丁标准溶液，室温避光保存。再从其中准确分别吸取0，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mL置于10 mL比色管中；滴加0.30 mL 5%亚硝酸钠溶液，静置3 min；再滴加0.30 mL 10%硝酸铝溶液，静置6 min充分反应；最后滴加2.00 mL 4%氢氧化钠溶液，摇匀，用体积分数70%乙醇定容至10 mL，静置15 min；用紫外可见分光光度计测定在510 nm下的吸光度。以芦丁质量浓度(mg/mL) 为横坐标、吸光度为纵坐标绘制芦丁标准曲线。

2.2 崀山脐橙皮总黄酮提取及含量测定

准确称取崀山脐橙皮粉0.50 g，放入三口烧瓶中，加入一定体积、一定浓度的乙醇溶液，放入微波化学反应器中，在一定的功率和温度条件下，微波提取一定时间，抽滤，用体积分数 70%的乙醇溶液洗涤滤渣3次，取滤液定容到50 mL容量瓶中。用移液枪准确移取5 mL待测液于10 mL比色管中，按照2.1节中标准曲线的绘制方法测定在510 nm波长下的吸光度(A),按照公式(1)计算崀山脐橙皮中黄酮提取量Y(mg/ g)[10]:

(1)

2.3 单因素试验

单因素实验参考文献[6]。称取崀山脐橙皮粉 0.50 g，在乙醇体积分数 70% 、料液比1∶20 g/mL、温度 60 ℃、微波功率为 480 W 的条件下，提取时间为4 min，分别考察提取次数(1，2，3，4和5次)的影响，时间间隔为10 min，通过计算黄酮提取量，选择合适的提取次数。

再分别考察提取时间(2，3，4，5和6 min)；提取温度(40，50，60，70和80 ℃)；微波功率(320，400，480，560和640 W)；乙醇体积分数(50% ，60%，70%，80%和90%)以及料液比(1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60 g/mL)对黄酮提取量的影响。

2.4 响应面设计方案

参照陈源等[12-13]的方法。在单因素的试验基础上，选取提取时间(A)、微波功率(B)、乙醇体积分数(C)和料液比(D)为影响因素，以黄酮的提取量作为响应值，利用 Design Expert 12.0 软件，根据 Box-Behnken 试验原理，设计四因素三水平实验方案，通过试验及数据分析，进一步得出微波辅助法提取崀山脐橙皮中总黄酮的最优工艺条件。试验设计见表 1。

表1 Box-Benhnken 设计试验因素水平及编码Table 1 Level and code of variables for Box-Benhnken design

2.5 崀山脐橙皮黄酮抗氧化活性的测定

崀山脐橙皮中总黄酮提取物对DPPH·清除能力的测定和ABTS+·清除能力的测定参照田建华等[11,14]的方法进行。

3 结果与讨论

3.1 芦丁标准曲线及回归方程

如图1所示，对标准曲线进行拟合，得线性回归方程：y=7.500 09x+0.004 040 93，R2=0.999 19。结果表明：在 0.01～0.05 mg/mL范围内芦丁质量浓度与吸光度之间线性关系良好。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 The standard curve of rutin

3.2 单因素试验结果

由图2(a)可知：崀山脐橙皮中黄酮提取量随着提取次数增多，先呈现逐渐增大的趋势，在提取到第3次后增加缓慢。考虑到时间和能源消耗，因此，微波提取的次数选择为3次。由图2(b)可知：黄酮提取量在2～4 min之间不断增加，在4 min达到最大值，超过4 min后提取量不断减少，可能是时间越长，导致黄酮类物质发生氧化降解[15]，使其含量下降。由图2(c)可知：改变提取温度对崀山脐橙皮黄酮提取量的影响不显著，在60 ℃ 时达到最大值。由图2(d)可知：当微波功率在480 W时黄酮提取量达到最大值，超过480 W黄酮提取量不断减少，可能原因是微波功率增大，破坏了黄酮提取物有效成分的结构，导致含量降低。由图2(e)可知：崀山脐橙皮黄酮提取量先随着乙醇体积分数增大先增加，在乙醇体积分数为 70% 时达到最大值，随后不断减小。可能是乙醇体积分数较小时，不能完全溶解黄酮类物质；当体积分数过大时，醇溶性的色素[16]及亲脂性强的成分溶出，在溶液中竞争同乙醇-水分子结合，降低了黄酮活性成分与乙醇-水分子的结合，降低了黄酮提取量。由图2(f)可知：崀山脐橙皮黄酮提取量随着料液比增大而增加，料液比在 1∶40 g/mL 时达到最大值。可能是随着料液比增大，溶剂的用量增加到一定程度后，黄酮活性成分基本溶出[17]，继续增大料液比会使非黄酮类其他醇溶性杂质析出，与活性成分共同竞争而导致含量下降[18]。

图2 崀山脐橙皮黄酮提取量的单因素实验Fig.2 Single factor experiment on extraction of flavonoids from Langshan navel orange peel

3.3 响应面优化试验及方差分析

3.3.1 响应面试验设计结果与方差显著性分析

由单因素试验结果，采用Box-Benhnken 响应面试验原理，选取了提取时间(A)、微波功率(B)、乙醇体积分数(C)和料液比(D)对提取量变化大的影响因素，以崀山脐橙皮总黄酮提取量为响应值，设计了四因素三水平的响应面试验，试验设计及结果见表2。

用 Design Expert 12.0 软件，对表 2 中的实验数据进行多元回归分析，得到表 3 的回归方程方差分析表；利用软件对数据进行非线性回归的二次多项式拟合，获得崀山脐橙皮黄酮提取量对提取时间(A)、微波功率(B)、乙醇体积分数(C)和料液比(D)的二次多元回归预测模型为：黄酮提取量Y= 2.93+0.081 7A+0.107 5B+0.280 0C-0.072 5D-0.160 0AB-0.015 0AC+0.005 0AD-0.070 0BC+0.152 5BD+0.105 0CD-0.251 2A2-0.220 0B2-0.243 8C2-0.197 5D2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由表3可知：对该模型进行显著性分析，F回归值=25.69，P<0.000 1，说明该回归模型显著，即各因素提取时间、微波功率、乙醇体积分数、料液比与黄酮提取量之间的线性关系显著，试验模型可靠；F失拟值=1.28，P=0.4362>0.05，说明失拟不显著，该试验有良好的稳定性，试验误差较小，该模型对试验拟合较好[11]。能够用来分析和预测微波辅助提取崀山脐橙皮总黄酮的最优工艺条件。

根据表 3 的P值可知:C,A2,B2,C2,D2的偏回归系数差异极度显著，说明乙醇体积分数对黄酮的提取量有极度显著的影响。A,B,D,AB,BD的偏回归系数差异高度显著，说明提取时间、微波功率、料液比对黄酮提取量有高度显著的影响，CD的偏回归系数差异显著，说明因素之间有交互影响，对响应值有非简单的线性关系。

表3 响应面试验方差分析表Table 3 Analyses of variance for the fitted regression model

根据表3的F值可知:单因素对崀山脐橙皮黄酮提取量的影响主次顺序为：乙醇体积分数、微波功率、提取时间和料液比。

3.3.2 响应面各因素间的交互作用分析

提取时间、微波功率、乙醇体积分数和料液比交互作用对崀山脐橙黄酮提取量的响应面图见图3，由图3(a)、3(f)可以看出：等高线呈椭圆形，且从表3中看出：AB，BD的P值为差异高度显著，说明提取时间与微波功率、微波功率与料液比之间的交互作用对黄酮提取量的影响较大。图3(e)可以看出：等高线呈微椭圆形，且表3中方差分析CD的P值差异显著，说明乙醇体积分数与料液比的交互作用对黄酮提取量的影响次之；其他的图3(b)、图3(c)、图3(d)的等高线近圆形，坡度相对平缓，说明提取时间与乙醇浓度、提取时间与料液比、微波功率与乙醇浓度间的交互作用对崀山脐橙皮中黄酮提取量的影响较小。

3.3.3 响应面优化的验证

采用 Design Expert 12.0 软件，分析得到崀山脐橙皮黄酮提取量的理论最佳值为3.02 mg/g，其对应的最佳提取工艺条件如下：提取时间为4.11 min、微波功率为489.68 W，乙醇体积分数为 75.56 %、料液比为1∶40.13 g/mL；考虑到试验操作的可行性，将最佳条件调整如下：提取时间为4 min、微波功率为480 W，乙醇体积分数为75%、料液比为1∶40 g/mL。在此条件下进行3次重复性试验，得到崀山脐橙皮黄酮提取量分别为2.93，2.96和2.98 mg/g，平均值为2.96 mg/g，与理论值相对误差为1.99%，说明该工艺优化得到的模型工艺参数是可靠稳定的。与王晓君等[6]的微波辅助复合酶法提取对比，酶的参与能进一步提高脐橙皮提取的黄酮含量。

3.4 崀山脐橙皮总黄酮提取物的抗氧化活性

崀山脐橙皮总黄酮提取物的DPPH·清除能力见图4(a)。在 0～200 mg/L的质量浓度范围内，随着质量浓度增加，对 DPPH·的清除能力快速增加。与阳性对照VC相比活性稍差，VC的IC50为34.253 mg/L ，提取物黄酮IC50为133.856 mg/L。崀山脐橙皮总黄酮提取物对ABTS+·清除能力的测定见图4(b),清除能力和阳性对照VC相当，VC的IC50为41.384 mg/L，崀山脐橙皮总黄酮提取物IC50为44.077 mg/L。

图4 崀山脐橙皮总黄酮提取物的抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activity of total flavonoids extract from Langshan navel orange peel

4 结论

本研究对微波法提取崀山脐橙皮总黄酮的提取工艺进行优化。通过响应面优化其工艺条件，确定了微波提取崀山脐橙皮总黄酮的最优工艺条件如下：提取时间为4 min、微波功率为480 W，乙醇体积分数为75%、料液比为1∶40 g/mL，在此条件下验证试验得到的黄酮提取量为2.96 mg/g，提取工艺条件条件温和、方法简单，具有一定的抗氧化活性。