窦建林， 宋景春， 余 甜， 吴 阳， 何龙平， 钟林翠， 林青伟中国人民解放军联勤保障部队第九〇八医院 重症医学科/南昌市血栓与止血学重点实验室，江西 南昌 330002

劳力性热射病(exertional heatstroke，EHS)指机体在高热环境下进行剧烈运动所造成的热平衡障碍，临床表现为可致死的急进性多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)[1-2]。流行病学调查显示，EHS患者凝血功能障碍的发生率可达40%～75%，且合并凝血功能障碍时，病死率可超过50%[3-4]。EHS相关的凝血功能障碍可表现为血管内皮细胞损伤、凝固时间延长、血小板功能障碍和纤溶活动异常，严重者可出现弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)[5]。早期识别EHS相关凝血功能障碍并及时阻断凝血功能障碍向DIC的演进，是改善EHS合并凝血功能障碍患者预后的重要措施[6]。核心温度过高是EHS导致凝血功能障碍的重要因素。发生EHS时，机体因热代谢障碍导致核心温度显著升高，体液蒸发致有效血容量不足，凝血系统受到热损伤和组织灌注不足双重打击，进而出现凝血功能障碍[7]。对于不同核心温度导致EHS相关凝血功能障碍严重程度的研究较少。本研究拟采用腹腔遥测温度胶囊实时监测大鼠核心体温，并分析不同核心温度EHS大鼠的凝血功能，以探讨EHS相关凝血功能障碍特征，为EHS合并凝血功能障碍患者的干预时机提供理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与仪器 选取SPF级SD大鼠25只，购于长沙天勤生物技术有限公司(动物生产许可证号：SCXK[湘]2019-0014)，适应性饲养7 d(5只/笼)，环境温度24℃～25℃，相对湿度40%～50%，自由摄食、摄水。sv-223植入式遥测温度胶囊(深圳菲明格科技有限公司)；KW-PT动物跑步机、KW-PT-WS恒温恒湿箱(南京卡尔文医疗科技有限公司)；BC-2600vet全自动动物血液分析仪器(深圳迈瑞医疗科技有限公司)；ACL-TOP700全自动凝血分析仪(美国沃芬公司)；GEM premier3500-血气分析仪(美国沃芬公司)；汇松MB-530多功能酶标仪(深圳汇松公司)。

1.2 遥测温度胶囊植入术 25只大鼠均于建立EHS模型前1周完成遥测温度胶囊腹腔植入术。术前24 h禁食，允许大鼠少量摄水。术前30 min，刺激大鼠排便并称重。10%水合氯醛(0.02 ml/g)腹腔麻醉，将大鼠置于手术台，消毒后于大鼠腹部前正中线切口，切口大小为1～2 cm；将消毒后的温度胶囊植入大鼠腹腔，分层缝合关闭腹腔，消毒手术部位(图1)。术后每日视察伤口情况。

1.3 实验分组 术后恢复1周后，将大鼠随机分为对照组(n=5)与模型组[40℃组(n=5)、41℃组(n=5)、42℃组(n=5)及43℃组(n=5)]。检测各组大鼠复制EHS模型前的基础数据。各组大鼠核心体温、体质量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

1.4 EHS模型建立 大鼠实验前24 h均禁食。实验舱的环境温度设置为40℃，相对湿度为70%。模型组大鼠同时放入大鼠跑步机中，以5 m/min的初速度开始跑步(坡度为0)，速度达到15 m/min后持续。大鼠运动过程中，实时检测各组大鼠核心温度，达到预定温度时即认为模型建立成功，并记录跑步时间和距离。

1.5 凝血相关指标 各组EHS模型大鼠在核心温度达标时，检测凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、血小板计数、纤维蛋白原、凝血酶时间(thrombin time，TT)、血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)、凝血酶敏感蛋白-1(thrombin-sensitive protein-1，TSP-1)、血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)、纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)和血乳酸水平；对照组大鼠在模型组大鼠进行实验前采血并对上述相关指标进行检测。

图1 遥测温度胶囊植入术

表1 各组大鼠复制EHS模型前的基础数据

1.6 常规凝血指标测定 使用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)管采集大鼠血液作为检测样本，采用全自动动物血液分析仪器检测血小板计数；使用枸橼酸钠抗凝管(枸盐酸与血液比例为1∶9)采集大鼠血液作为检测样本，室温下以3 000 r/min离心10 min分离样本血清，采用全自动凝血分析仪检测PT、APTT、TT、纤维蛋白原；使用肝素化注射器抽取0.5 ml大鼠血液，采用血气分析仪检测乳酸水平。

1.7 酶联免疫吸附法 采用酶联免疫吸附法检测大鼠血浆TM、vWF、TSP-1和PAI-1水平。取大鼠血浆或标准品100 μl加入反应孔，按试剂盒说明书依次完成混匀、温浴、洗涤、加入抗体、温浴、显色等操作步骤，用酶标仪在450 nm处测定吸光值。

2 结果

2.1 不同核心温度EHS大鼠状态 核心温度40℃～41℃的大鼠精神状态基本正常，呼吸较均匀，口鼻及四肢红润，体表出现少量汗液。核心温度42℃～43℃大鼠精神状态萎靡，毛发悚立、呼吸急促，口鼻出现淡红色泡沫状液体，四肢肿胀、紫绀，体表可见大量汗液。核心温度43℃的大鼠大多数对任何疼痛刺激无反应。随着运动距离逐渐增加、运动时间逐渐延长，EHS大鼠核心温度呈升高趋势。40℃组、41℃组、42℃组大鼠的运动距离和运动时间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。43℃组大鼠的运动距离和运动时间均长于40℃组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 EHS大鼠运动距离及时间比较

2.2 常规凝血试验指标比较 40℃组、41℃组、42℃组、43℃组大鼠的血小板计数均较对照组明显降低，且随核心温度升高而明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。41℃组、42℃组、43℃组大鼠的PT、APTT较对照组、40℃组明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)。43℃组大鼠的TT较对照组、40℃组、41℃组明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)。42℃组、43℃组大鼠血乳酸水平较对照组、40℃组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。40℃组、41℃组大鼠纤维蛋白原水平较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)。42℃组、43℃组大鼠纤维蛋白原水平较40℃组、41℃组下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠常规凝血试验指标比较

2.3 凝血分子标志物比较 42℃组、43℃组大鼠的TM水平较对照组、40℃组明显升高，且42℃组大鼠的TM水平较41℃组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。40℃组、41℃组、42℃组、43℃组大鼠vWF较对照组明显升高，且42℃组、43℃组高于40℃组、41℃组，差异均有统计学意义(P<0.05)。41℃组、42℃组、43℃组大鼠TSP-1较对照组明显升高，且43℃组大鼠TSP-1较40℃组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。大鼠PAI-1水平随核心温度升高呈升高趋势，其中，对照组、40℃组、41℃组、42℃组大鼠PAI-1水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；43℃组大鼠PAI-1水平较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠凝血分子标志物比较

3 讨论

发生热射病时，机体因热代谢障碍导致核心体温升高，血管内皮细胞在高温下出现损伤，进而激活血小板和凝血因子，引起促凝反应[8]；同时，体液容量减少引起胃肠道损伤，菌群易位导致脓毒症，加重血管内皮细胞损伤[9]。TM、vWF可反映血管内皮损伤程度[10-11]。本研究发现，EHS大鼠在核心温度40℃时即出现vWF水平明显升高，42℃时出现TM水平明显升高，这一方面说明EHS大鼠的血管内皮损伤程度具有温度依赖性，另一方面也提示vWF对血管内皮细胞损伤的识别早于TM。

TSP-1是20世纪70年代发现的一种细胞外基质糖蛋白，主要分布在血小板颗粒中，TSP-1水平增高提示血小板分泌增强[12]。热射病发生过程中，广泛内皮细胞损伤可激活血小板，促发凝血瀑布导致血小板过度消耗；热射病伴随的炎症介质释放也可激活血小板，造成血小板快速减少；此外，热损伤亦可直接导致血小板破坏[13]。本研究结果显示，EHS大鼠在核心温度40℃时即出现显著的血小板减少，提示血小板减少是评价EHS相关凝血功能障碍的敏感指标。EHS大鼠血小板减少的同时可出现存活血小板分泌TSP-1等分子的活动增强。Wang等[14]将洗涤过的血小板在40℃环境下培养1 h发现，高温下不仅二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和凝血酶诱导的血小板聚集率明显降低，血小板还可出现线粒体内跨膜电位去极化、caspase-3依赖性凝胶蛋白裂解和磷脂酰丝氨酸暴露，进而导致血小板凋亡。上述研究与本研究分别从细胞水平、动物整体层次证明高温对血小板功能的影响，同时，也都证实核心温度40℃是引起EHS相关血小板功能障碍的重要危险因素。

PT、APTT和TT依次反映与外源性、内源性和共同凝血途径有关的凝血因子活性。有研究证实，热射病时PT、APTT延长是患者60 d死亡的独立危险因素[15]。本研究显示，核心温度达41℃时，EHS大鼠的PT、APTT明显延长；核心温度达43℃时，EHS大鼠的TT明显延长，这说明EHS时凝血因子活性明显下降是凝血功能障碍发展到相对晚期的表现。PAI-1可反映纤溶功能[16]。本研究中，核心温度43℃时，PAI-1水平出现显著升高，提示EHS发生时，可出现纤溶异常。既往研究报道，热射病时的PAI-1水平显著升高可能导致的纤溶抑制状态属于EHS相关凝血功能障碍的晚期表现[17]。这与本研究PAI-1水平在大鼠核心温度为43℃才有显著升高相一致。

血乳酸水平可反映组织微循环灌注[18]。热射病时体液大量丢失，有效循环血量严重不足造成组织低灌注，临床可表现为乳酸升高。乳酸升高导致局部酸中毒，可引起微血管麻痹和微血栓形成，加重组织缺血缺氧，进一步加重乳酸酸中毒，导致恶性循环[19]。同时，肠道缺血缺氧引起继发脓毒症，可加重凝血障碍和组织缺血，加重乳酸酸中毒和休克[20]。核心温度升高到42℃时，EHS大鼠出现血乳酸水平明显升高，说明核心温度42℃时已出现严重的微循环障碍，这也是临床进行抗凝治疗的适应证[21]。

综上所述，EHS大鼠在核心温度达到40℃时即可出现内皮细胞损伤、血小板计数减少,核心温度达到41℃可出现凝血时间延长，核心温度达到42℃可出现显著微循环障碍。不同核心温度时EHS大鼠凝血功能障碍的特征既解释EHS时凝血功能障碍的机制，又提示临床治疗EHS相关凝血功能障碍时，可参考核心温度采取相应的诊疗策略。